通过促进分枝状DNA复合体的形成的核酸检测方法技术

公开了通过促进分枝状DNA复合体的形成的核酸检测方法。通过在同一反应混合物中合并进行PCR、加热变性及杂交来促进单链寡核苷酸探针与大量扩增的标靶DNA之间的分枝状（branched）DNA的自组装，从而能够显著地增加标靶核酸的检测信号及敏感度。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及通过促进分枝状(branched) DNA的形成显著地增加检测信号及敏感度的核酸检测方法，更具体地，涉及通过在溶液内或在固体支持体的表面合并进行同一反应混合物的聚合酶链反应(Polymerase ChainReaction, PCR)及杂交而促进短的核酸探针与大量扩增的标靶DNA之间的分枝状DNA的自组装(self-assembly),从而显著地增加标靶核酸的检测信号及敏感度的方法。
技术介绍
通常，利用单链短的核酸探针(通常为DNA或PNA)的诊断方法是为了诸如确认或检测致病基因、突变、感染源(infectious agents)(例如病毒、微生物等)、基因型分型(genotyping)、基因的表达等各种目的而使用的。短的核酸探针大体上固定于玻璃板、金属板、珠粒等各种固体表面而使用。例如，利用短的核酸探针的DNA微阵列(或DNA芯片)的主 要优点之一是，可以同时分析大量不同的标靶核酸序列。这种技术在病院或诊所的诊断用途中被采用，并且，为了在临床诊断中的方便的使用及/或可靠性的确定，而与其他各种技术合并而达到最优化。利用短的核酸探针的诊断方法通常要求如下所述的长的工艺。(a)从生物试样(例如组织、细胞、血液、血清、体液等)提取核酸(DNA或RNA)、(b)标靶核酸的扩增、及(c)最后进行扩增的核酸序列与固定于固体(例如载玻片或珠粒)表面上的短的核酸探针的杂交。在这里，在为了检测RNA序列的情况下，首先在扩增前通过逆转录反应使RNA转换为DNA。根据为检测上述标靶核酸所要求的通常的工艺可知，利用短的核酸探针的分子生物学诊断方法会投入大量的劳动、费心费事并且消耗大量的时间。因此，要求用于便利且经济并且以高处理量地分析核酸序列的简化的步骤，这对于病院及诊所的临床诊断而言特别重要。另外，其他的重要的问题是为了检测杂交的产物而使用的方法的敏感度(sensitivity)。检测敏感度在感染源(例如病毒、微生物等)的检测中特别重要,并且对于治疗的预后(prognosis)而言较为重要。例如感染源的治疗的成功与否可以通过残留在人的体液(例如血液)中的残留感染源的数量来判断。另外，其他的例子是癌治疗的成功与否可以通过致癌基因的存在(因此，癌细胞的存在)来判断。通常已知，利用固定于固体表面的短的核酸探针的标靶核酸序列的检测敏感度，比实时PCR (real-time PCR)的敏感度还低数倍。因此，必须开发能够提高利用短的核酸探针的检测敏感度的方法、理想的是具有提高至能够检测I个标靶分子的水平的敏感度的检测方法。使用如下的诊断方法，即不经过诊断对象的核酸的扩增而合成连结大量标记的分枝状DNA (branched DNA)、将其通过与二分节寡核苷酸探针(bipartite oligonucleotideprobe)即分枝状DNA杂交、通过与结合于固体上的捕获探针的诊断对象的核酸连结的寡核苷酸获得高的信号与敏感度；因此，在外部合成分枝状DNA，除了固定于固体上的捕获探针以外，也必须合成识别诊断对象的二分节寡核苷酸。这种技术的敏感度较高，但具有花费较长时间且必须经过较多过程的短处。本专利技术是为了解决前述问题而提出，在利用短的核酸探针检测标靶核酸的方法中，提供通过促进短的核酸探针与大量扩增的标靶DNA之间的分枝状DNA复合体的自组装而显著地増加检测信号及敏感度的方法。根据本专利技术的ー个方面，提供试样中的标靶核酸分子的检测方法，其包括在和包含与欲检测的标靶核酸分子的全部或一部分互补的序列的单链核酸探针的存在下，合并进行上述标靶核酸分子的扩增与杂交，而在上述核酸探针处杂交大量扩增的核酸分子，从而促进分枝状(branched)核酸复合体的形成的步骤；及检测上述杂交的分枝状核酸复合体的步骤。根据ー个具体例，上述扩增可以通过不对称聚合酶链反应(asymmetricPCR)来进 行，但并不限定于此，即便在进行通常的PCR的情况下，在使用过量的引物浓度时，也可以促进分枝状核酸复合体的形成。根据ー个具体例,在促进上述分枝状(branched)核酸复合体的形成的步骤中，上述分枝状(branched)核酸复合体可以自组装，但并不限定于此。根据ー个具体例，促进上述分枝状核酸复合体的形成的步骤可以通过利用温控循环机(thermocycler)调节温度、温度循环的时间及温度循环的次数来进行，但并不限定于此。上述标靶核酸分子的扩增与杂交的合并是指在固体支持体的表面(例如微阵列的表面、容器或管内的表面、或珠粒表面等)或容器内的溶液中在同一反应混合物内进行扩增与杂交，通过使温控循环机与固体支持体或容器相结合而调节上述固体支持体或容器的温度、温度循环的时间及次数，从而可以容易地合并进行扩增与杂交，并且可以将这种调节程序化而自动进行检测过程。与上述扩增及杂交的合并相关的内容在本申请的专利技术人的国际申请PCT/US2006/049395中记载有更详细的说明，上述专利文献是将全部的内容合并进本说明书中。根据ー个具体例，上述试样可以包括全血、血清、体液、生物组织、细胞、微生物、病毒或病毒粒子，但并不限定于此，如果是能够含有欲检测的标靶核酸的试样，则可以是任意的试样。根据ー个具体例，上述试样可以是未经过核酸分子的分离及纯化过程的试样，但并不限定于此，当然也可以使用经过核酸分子的分离及纯化过程的试样。根据ー个具体例，在上述试样是未经过核酸分子的分离及纯化过程的试样时，在合并进行上述扩增及杂交前，为了使上述试样中的核酸露出，而可以添加进行表面活性剂处理、酶处理或加热处理，但并不限定于此。与不经过核酸分子的分离及纯化过程而合并进行扩增及杂交相关的内容，在本申请的专利技术人的国际申请PCT/US2009/034809中记载有更详细的说明，上述专利文献是将全部的内容合并进本说明书中。根据ー个具体例，上述欲检测的标靶核酸分子可以是存在于不含细胞的试样内的核酸分子、存在于病毒粒子或非真核细胞中的核酸分子、病原体的核酸分子等，但并不限定于此。根据一个具体例，上述欲检测的标靶核酸分子是包含突变的序列的核酸分子，上述探针可以与包含上述突变的序列的标靶核酸分子互补，但并不限定于此。根据一个具体例，上述标靶核酸分子可以是DNA分子或由RNA分子逆转录的cDNA分子，但并不限定于此。根据一个具体例，上述标靶核酸分子是RNA分子，上述促进杂交的分枝状(branched)核酸复合体的形成的步骤可以合并进行上述标祀RNA分子的逆转录、扩增及杂交，但并不限定于此。在这里，上述扩增是通过不对称聚合酶链反应(asymmetric PCR)来进行，但并不限定于此，即便是进行通常的PCR的情况下，在使用过量的引物浓度时，也可以促进分枝状核酸复合体的形成。根据一个具体例，上述核酸探针可以是单链DNA或PNA序列，但并不限定于此。 根据一个具体例，上述核酸探针可以存在于溶液内或存在于固体支持体上，但并不限定于此。在上述核酸探针存在于溶液内时，标靶核酸分子的扩增与杂交可以在单一容器内合并进行。并且，在上述核酸探针存在于固体支持体上时，可以在固体支持体上合并进行标祀核酸分子的扩增与杂交。作为上述固体支持体，可以利用各种固体表面，例如可以利用塑料管、塑料容器(well)、玻璃容器、珠粒(bead)、载玻片本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡治范，金景泰，姜宗勋，
申请(专利权)人：科美仪器，
类型：
国别省市：