本发明专利技术涉及下述蛋白，所述蛋白展示天冬酰胺酶活性并具有根据SEQID?NO.2–SEQ?ID?NO.10的氨基酸序列。本发明专利技术的蛋白的优点是，其在酸性、中性和碱性下展示的天冬酰胺酶活性(EC?3.5.1.1)的比活性比野生型天冬酰胺酶的比活性高许多倍。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及新颖蛋白及编码所述蛋白的多核苷酸序列。更具体地，本专利技术涉及具有天冬酰胺酶活性的蛋白和使用这些蛋白的方法。专利技术背景近来,公开了丙烯酰胺在很多经加热食物产品中出现(Tareke et al. Chem. Res. Toxicol. 13，517-522 (2000))。鉴于丙烯酰胺被认为可能对动物和人致癌，该发现产生了世界范围的关注。进一步的研究揭示，在多种经烘焙、煎炸和烤箱制备的常见食物中可检测到相当含量的丙烯酰胺，并且显示，食物中丙烯酰胺的出现是加热过程的结果。Mottram et al. Nature419 :448(2002)已提出了作为Maillard反应的结果从氨基酸和还原糖形成丙烯酰胺的途径。根据该假说，丙烯酰胺可在Maillard反应期间形成。在烘焙和烘烤 (roasting)期间,Maillard反应负责颜色、气味和味道。与Maillard相关的反应是氨基酸的Strecker降解，提出了形成丙烯酰胺的途径。当温度超过120°C，可检测到丙烯酰胺的形成，在170°C左右观察到了最高的形成速率。当存在天冬酰胺和葡萄糖时，可观察到最高的丙烯酰胺水平，而谷氨酰胺和天冬氨酸仅导致痕量丙烯酰胺。EU中针对丙烯酰胺从食物接触的塑料迁移进食物的官方迁移限制被设置为 IOppb(每kg 10微克)。虽然对烹饪期间形成的丙烯酰胺尚没设置官方限制，但是很多产品(尤其是谷物类、面包产品和基于马铃薯或玉米的产品)超过该值这一事实导致了人们的关注。已知若干植物原材料含有大量水平的天冬酰胺。在马铃薯中，天冬酰胺是主要的游离氨基酸(940mg/kg，对应总氨基酸含量的40% )，在小麦面粉中，天冬酰胺以大约167mg/kg的水平存在，对应于总游离氨基酸的14% (Belitz and Grosch in Food Chemistry-Springer New York, 1999)。丙烯酰胺主要从天冬酰胺(组合还原糖)形成，这一事实可解释经煎炸、烤箱烹饪或烘烤的植物产品中丙烯酰胺的高水平。因此，就公众健康方面而言，急切需要具有低得多的丙烯酰胺水平，或者优选全无丙烯酰胺的食物产品。已经提出了多种减少丙烯酰胺含量的解决方案，或者通过改变加工变量，例如，力口热步骤的温度或持续时间，或者通过化学方式或酶促方式防止丙烯酰胺形成或者通过除去形成的丙烯酰胺来实现。 在若干专利中请中，已经公开了天冬酰胺酶用于减少天冬酰胺水平以及由此减少形成的丙烯酰胺的量的用途。已从若干种真菌来源产生了用于该目的的合适的天冬酰胺酶，例如，从 Aspergillus niger (W02004/030468 中)和 AspergiIIus oryzae (W004/032648 中)。虽然所有L-天冬酰胺酶都催化同样的化学转化，但这并不意味着它们适合用于同样的应用。多种不同的应用对酶操作的必要条件提出了不同的要求。可能影响到酶促转化速率的物理和化学参数是温度(对化学反应速率有正面影响，但是可能对酶稳定性有负面影响)、水分含量、pH、盐浓度、食物基质的结构完整性、酶的活化剂或抑制剂的存在、底物和产物的浓度等。因此，人们正需要改进的天冬酰胺酶，其具有改进的性质适于多种应用。专利技术详沭本专利技术涉及展示天冬酰胺酶活性并显示下述比活性的多肽(i)在37°C的温度下在pH 5和pH 8之间的pH下,是SEQ ID NO : I的A. niger野生型天冬酰胺酶的比活性的至少两倍，和Qi)其在PH 5、pH 6和pH 7下比在这些pH值下的来自WO 2008/128974的变体天冬酰胺酶ASN02 (在本专利申请的SEQ ID NO 20中描绘并对应于W02008/128974中的SEQ IDNO 5)的比活性至少高10%。此类蛋白具有在SEQ ID NO. I的位置63上的天冬氨酸、甘氨酸或组氨酸和在位置88上的丝氨酸、苯丙氨酸或缬氨酸，SEQ ID NO. I是如在WO 04/030468中公布的A. niger野生型天冬酰胺酶的序列。优选地该多肽与在SEQ ID NO 1 中描绘的野生型A. niger天冬酰胺酶具有至少90%、优选地至少95%的同一'丨生程度(％同一 I"生)。术语“ 同源性”或“百分比同一性”在本文中可互换使用。就本专利技术的目的而言， 在此定义为确定两条氨基酸序列或两条核酸序列的百分比同一性，本着最优比较的目的 (例如，可以在第一条氨基酸序列或核苷酸序列上引入缺口，以与第二条氨基酸序列或核苷酸序列达到最佳的比对)，将所述序列进行比对。然后对相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸进行比较。当第一条序列上的位置被与第二条序列中相应位置处相同的氨基酸或核苷酸残基占据，那么这两条分子在该位置是相同的。两条序列间的百分比同一性是所述序列共有的相同位置的数量的函数(即，％同一性=相同位置的数量/位置 (即重叠位置)总数X100)。优选地，两条序列长度相同。可在被比较的两条序列全长上或两条序列片段上进行序列比较。典型地，在被比较的两条序列的全长上进行比较。但是，可在例如二十个、五十个、一百个或更多个相邻的氨基酸残基的区域上确定序列同一性。技术人员将知道，有若干计算机程序可被用于确定两条序列间的同源性。例如，可以使用数学算法来完成对序列的比对和对两条序列间百分比同一性的确定。在一种优选的实施方式中，使用 Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. (48) :444-453 (1970))算法来确定两条氨基酸序列间的百分比同一'I"生，所述算法已被加入到GCG软件包(可从http://www. gcg. com MU )的GAP程序中，其中使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵，缺口权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。技术人员将知道，所有这些不同的参数将导致有细微区别的结果，但是使用不同算法时两条序列的总体百分比同一性不会有显著改变。本专利技术的核酸和蛋白序列还可被用作“查询序列”来开展对公众数据库的搜索，例如，以鉴定相关序列或家族中其它成员。可以使用Altschul，et al. (1990) J. Mol. Biol. 215 :403-10的BLASTN和BLASTX程序(2. O版)来开展此类搜索。可以用BLASTP程序，以分数=50，字长=3来进行此类BLAST蛋白搜索，以获得与本专利技术的蛋白分子同源的氨基酸序列。本着比较的目的，为获得有缺口的比对，可以利用Altschul et al.，(1997) Nucleic Acids Res. 25(17) :3389-3402 中描述的 Gapped BLAST。当利用 BLAST 和 Gapped BLAST程序时，可以使用各个程序(例如BLASTP和BLASTN)的缺省参数。见http://www. ncbi. nlm. nih. gov。本专利技术的蛋白的一个优势是，它们在中性、酸性和碱性pH下展示具有高比活性的天冬酰胺酶活性(EC 3. 5. I. I)。在一些实施方式中，在这些pH值下，比活性比野生型天冬酰胺酶的比活性高超过6倍(pH 7)或超过30倍(pH 8)。在本专利技术中，术语“比活性本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：简·米特斯卡·拉恩·范德，艾瑟·兰格·德，马克·克里斯蒂安·斯托，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
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