本发明专利技术属于生物技术制药领域，具体涉及一种血清microRNAs试剂盒及其应用。本发明专利技术在基因组范围内通过solexa测序筛选出在正常人和患者血清中表达存在明显差异的一组miRNAs，然后利用RT-qPCR法进行了两个阶段独立样本的复筛和验证,筛出了由5个miRNAs（miR-21,miR-29a,miR-200a,miR-25和miR-486-5p）组成的宫颈癌血清指纹谱。本发明专利技术通过ROC曲线分析，发现筛选出的这组血清miRNAs标志物对于诊断宫颈癌具有较高的灵敏度和特异性。由此制备了一种能用于宫颈癌早期检测的诊断试剂盒。所述组合、方法能够用于宫颈癌的早期检测，具有高特异性、高效性、高灵敏度、检测成本低、取材方便、样本易存放等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术制药领域,具体涉及ー种血清microRNAs试剂盒及其应用。
技术介绍
宫颈癌是女性常见恶性肿瘤之一，是指发生在子宫阴道部及宫颈管的恶性肿瘤。宫颈癌的发病率仅次于乳腺癌，居于女性肿瘤发病率的第二位，全球每年约有50万宫颈癌新发病例，占所有癌症新发病例比重高达5%，我国毎年新发宫颈癌病例约为13. 2万，属于高发区。宫颈癌的死亡率也很高，全球每年约有23万女性死于宫颈癌，我国每年约有3万女性死于宫颈癌。采取有效的诊断方法，早期诊断早期治疗，能够有效降低癌症的发生率，提闻治愈率。MicroRNAs (miRNA)是ー类长度约为22nt的非编码单链小分子RNA，miRNA基因以 单拷贝、多拷贝或基因簇等形式存在于基因组中，并且大部分定位于基因间隔区，在进化上高度保守，MiRNA的转录独立于其他基因，不具有开放阅读框(ORF)所以不翻译成蛋白质，而是在体内多种生理过程中起到调控作用，包括细胞増殖、分化、凋亡等。本实验室前期通过系统的研究发现miRNAs稳定地存在于哺乳动物的血清中。血清中稳定存在多种miRNA的发现也引起了人们对其来源和产生方式的研究和探索。目前认为血清中的miRNA与相关组织的分泌密切相关。MiRNAs具有内在的调控基因表达的功能，提不那些在肿瘤中特异性表达的miRNAs可能在肿瘤的发生和发展的过程中发挥特殊的作用，近期，在对肿瘤患者血清miRNAs变化机制的研究中发现，在肿瘤中高表达的miRNA可能发挥与癌基因相似的作用，而在肿瘤中低表达的miRNA可能与抑癌基因有相似的作用，这对于肿瘤的临床诊断、治疗方案的选择和预后具有指导意义。与组织检测方法相比，以血清作为检测样本具有取材方便、基本无创伤性、可连续体外检测等优点。构建肿瘤特异性血清microRNA表达谱，有望成为ー种基于血清检测癌症的分子标记。
技术实现思路
本专利技术的需要解决的问题是通过检测宫颈癌血清中miRNA的表达水平，筛选并鉴定能够作为宫颈癌检测标志物的血清miRNAs,进行血清miRNA检测试剂盒的研制。I.本专利技术首先在基因组范围内通过solexa测序筛选出在正常人和患者血清中表达存在明显差异的ー组miRNAs ;然后利用RT-qPCR法进行了两个阶段独立样本的复筛和验证；最后利用ROC曲线法分析其灵敏度和特异性。2.血清采集均严格按照如下步骤进行收集患者和正常人全血，在室温下3000g离心IOmin去除血细胞并收集血清，然后将收集的血清在4°C条件下，12000g离心15min，进一歩去除残留的血细胞，离心后收集血清置于-80°C冰箱保存待用。3. ー组由5种血清miRNAs组成的宫颈癌血清诊断标志物，分别是miR-21,miR-29a, miR-200a, miR-25和miR-486_5p。ROC曲线分析结果显示，对比传统血清SCC和CA125检测，血清miRNAs标志物具有高灵敏度和特异性。本专利技术与现有技术相比其有益效果是筛选出的疾病特异血清miRNA，进行血清miRNA检测试剂盒的研制，该芯片可以识别宫颈癌病人的发病及分级情況，实现宫颈癌早期诊断的目的。本专利技术的主要创新点包括血清miRNA是ー种新型生物标志物；血清miRNA监测是一种系统、全面的检测试剂盒，与组织检测方法相比，以血清作为检测样本具有取材方便、基本无创伤性，本专利技术采用严密、多阶段的验证和评价体系。四附图说明图I为5种血清miRNAs在宫颈癌患者和正常人中表达存在明显差异； 图2由5种血清miRNAs组成的宫颈癌标志物的ROC曲线分析结果 图3为本专利技术实验设计流程 五具体实施方式 I、进行Solexa测序实验时，我们分别混合了 20例宫颈癌患者(每人2ml)和20位健康对照(每人2ml)的血清。每组混合血清的总RNA是严格按照Trizol LSReagent (Invitrogen, Carlsbad, CA)的人工操作指南提取的。I) 将收集的血清样本包括AMI组和正常对照组的血清分别进行混合，得到两组混合血清，体积均为40 ml，分别提取混合血清RNA。2) 按混合血清体积(均为40 ml) 2:1的比例加入TRIzol，用力震荡均匀后，室温静置15min，然后加入TRIzol 1/5体积的氯仿，用力震荡均匀，室温静置15min。3) 静置结束后10000 g，4°C，离心15 min，离心毕收集上清。4) 将3)中收集的上清置于除酶管子中，加入上清等体积的水饱和酚，用カ震荡均勻后 10000 g，4°C，离心 5 min。5) 离心毕，收集上清,加入上清1/2体积的水饱和酚和1/2体积的氯仿，用力震荡均勻后10000 g,4°C,离心5 min。6) 离心毕，收集上清，加入上清等体积的氯仿，用力震荡均匀后10000 g，4°C，离心5 min。7) 离心毕，收集上清，加入上清等体积的异丙醇，用力震荡均匀后在冰上沉淀I h 后 10000 g，4°C，离心 30 min。8) 离心毕，去上清，留沉淀，先用3 ml 75%的こ醇逐个清洗管子，然后用3 ml的TRIzol清洗こ醇洗涤后的管子。こ醇清洗后分装到除酶的2 ml的离心管后12000 g，4°C，离心 15 min。9) 离心毕，取沉淀，用8)中洗管壁的TRIzol分别再次完全溶解沉淀，加入Trizol 1/5体积的氯仿,混勻室温静置10 min后12000 g,4°C,离心15 min。10)离心毕，取上清，加入上清等体积异丙醇，冰上静置15 min后12000 g，4°C，离心 15 min。11)离心毕，去上清，留沉淀，用I ml 75%的DEPCこ醇加入沉淀中涡漩后12000g, 4°C,离心 15 min。12)离心毕，去上清，留沉淀，待沉淀干燥后加50 ul DEPC水至RNA完全溶解，测定RNA浓度。2、在做RT-qPCR实验吋，我们用酚/氯仿抽提法在200 U I血清中提取RNA。13)将250 U I血清放入已除酶的I. 5 ml离心管中，加入250 U I DEPC水稀释，涡旋混匀。14)混匀毕,加入250 U I水饱和酹并剧烈震荡,室温静置两分钟,然后加入250U I氯仿，剧烈震荡在室温静置5 min后4°C，12000 g，离心5 min。15)离心毕，取上清，加入上清1/10体积的醋酸钠溶液(C=3M/L，pH=5. 3)并加入上清两倍体积的异丙醇，涡旋混匀后_20°C静置30 min,4°C, 12000 g离心20 min。16)离心毕，去上清，留RNA沉淀，加入I ml 75% DEPCこ醇，涡旋混匀，洗涤RNA沉淀，洗涤毕4°C，12000 g，离心20 min。17)离心毕，去上清，留沉淀，在室温下晾干沉淀约10 min后加入20 DEPC水， 溶解RNA沉淀。待RNA完全溶解之后放入_80°C低温冰箱留存待用。3、本文使用 TaqMan探针引物(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)利用RT-qPCR技术定量分别检测特异性miRNA和基因的表达。针对每一 miRNA均设计了ー个含相同莖环结构(stem-loop structure)的基因特异性反向引物,将所有的基因特异性反向本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种血清microRNAs试剂盒，其特征是由5种血清miRNAs组成的宫颈癌血清检测标志物，5种标志物为miR？21,？miR？29a,？miR？200a,？miR？25和miR？486？5p。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：项阳，吴元赭，贾文慧，张辰宇，张秦，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。