沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物在制备防治炎症性肠病药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白在防治炎症性肠病药物研发中的用途。本发明专利技术证实，沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白对肠道炎症性疾病如溃疡性结肠炎和克罗恩病等具有良好的预防和治疗效果，可以该蛋白为活性成分，制备成预防和治疗炎症性肠病的药物。本发明专利技术可解决现有炎症性肠病治疗药物疗效差、起效慢、疗程长、副作用大的问题，可显著减少患者治疗过程的痛苦，促进患者的身体康复和提高生存质量。本发明专利技术将在炎症性肠病及其它部位炎症的预防和治疗中发挥重要作用，应用前景广阔。

【技术实现步骤摘要】
沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物在制备防治炎症性肠病药物中的应用
本专利技术属于医药领域中重组蛋白在药物研发中的新用途，特别是涉及一种沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物(代号CZLC331)在研制用于防治炎症性肠病药物中的新用途。
技术介绍
溃瘍性结肠炎(Ulcerative Colitis,UC)又称特发性溃瘍性结肠炎或慢性非特异性溃疡性结肠炎，是一种以粘膜及粘膜下层浸润为主、特发于大肠的慢性非特异性炎症性肠病，主要临床症状表现为腹痛、腹泻、粘液便和血便，并伴有多发性硬化症、视神经炎和骨质疏松等病症。由于该病具有治疗难度大、疗程长及易复发等特点，已被世界卫生组织确定为现代难治病。虽然现已有多种炎症性肠病治疗药物，如氨基水杨酸类药物、糖皮质激素类药物和免疫抑制剂等，但是它们却具有疗效差(尤其是中重度UC)、起效慢、疗程长、副作用大等缺点，因此，市场上迫切需要一种疗效显著、起效快、疗程短、安全性高、副作用小、用药方便的预防和治疗炎症性肠病(特别是慢性非特异性溃疡性结肠炎)的药物。关于沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物，已有研究表明，沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物 CBLB502(标准命名)对造血系统有保护作用，可延长高剂量放射损伤后小鼠的生存时间，并可提高低剂量照射小鼠的生存率(Lyudmila G. Burdelya, et al, .An Agonist ofToll-Like Receptor 5 Has Radioprotective Activity in Mouse and Primate Models. Science 2008 ;320 (5873) :226-230)。深入研究发现沙门氏菌鞭毛蛋白及包含其 N-和C-端保守结构域的衍生物均具有辐射防护作用，能够有效提高小鼠骨髓中造血干细胞数量有效地预防致死剂量照射引起的小鼠死亡，其机制为通过NF- K B信号通路发挥抗凋亡作用。提示该沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物CBLB502可向抗辐射药物方向发展。目前并没有任何关于沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物向抗辐射药物以外其它药用·方向的研究报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331在防治炎症性肠病药物研发与制备中的用途。本专利技术所述沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331对炎症性肠道疾病如溃疡性结肠炎和克罗恩病等具有良好的预防和治疗效果，因此，以该蛋白为活性成分，可以制备成预防和治疗炎症性肠病的药物。本专利技术所述沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331是包括Tat蛋白转导肽、沙门氏菌鞭毛蛋白自N端第1-176位氨基酸残基和第402-505位氨基酸残基的融合蛋白；所述沙门氏菌鞭毛蛋白自N端第1-176位氨基酸残基和第402-505位氨基酸残基可通过柔性连接肽连接。可采用常规原核表达方法制备沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331，纯度大于 95%。具体制备沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331的方法可包括以下步骤I)合成沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC296编码基因，其核苷酸序列如序列表中序列I所示；所述沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC296是通过柔性臂将沙门氏菌鞭毛蛋白自N 端第1-176位氨基酸残基和自N端第402-505位氨基酸残基连接得到的；2)将人工合成的沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC296编码基因克隆到携带Tat转导肽编码序列的原核表达载体中，得到携带Tat蛋白转导肽编码序列和沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC296编码基因的原核表达载体；所述N端连接有Tat蛋白转导肽的沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物命名为CZLC331,编码该蛋白的基因的核昔酸序列如序列表中序列2所不；3)将重组表达载体pET28b-Tat-CZLC331转化入宿主菌；4)诱导表达含有携带Tat蛋白转导肽编码序列和沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物 CZLC296基因的原核表达载体的宿主菌；5)分离及纯化表达的重组蛋白，得到沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白。在上述沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331制备方法中，所述步骤2)中携带 Tat转导肽编码序列的原核表达载体为任意一种可在大肠杆菌中表达的原核表达载体， 如pET-22b系列、pET-28系列或pET-15系列等，优选为pET28b_Tat ；以pET28b_Tat为出发载体构建的携带沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物C Z L C 3 31编码基因的重组表达载体为 pET28b-Tat-CZLC331。步骤3)中的宿主菌可为 E.coli BL21(DE3)、Ε· coli ER2566 (DE3)、 E. coliBL21(DE3，plysS)、E. coli JM109、E. coli HBlOl 或 Ε· coli ToplO 等，优选为 E. coliBL21(DE3)。本专利技术所制备的含有CZLC331蛋白的药物可以制成注射液、口服液、灌肠液、胶囊、肠溶片、粉剂或粒剂等多 种形式，优选为注射液、灌肠液或肠溶片。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。所述胶囊、肠溶片、粉剂和粒剂等固态剂型的药物中活性成分沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白的质量百分含量可为1-35%。所述注射液、口服液和灌肠液等液态剂型的药物中活性成分沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白的浓度可为2-64g/L。需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的辅料，包括药学领域常规的吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂、稳定剂、稀释剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、 稀释剂、吸附载体、赋形剂等，必要时还可加入色素、甜味剂及香味剂等。具体的，所述药物可以为蛋白注射液，由重量体积比为5% (5g/100mL)的CZLC331 蛋白、0.85% (0. 85g/100mL)的氯化钠和注射用水组成。或者，所述药物为肠溶片，由CZLC331蛋白100重量份，乳糖60重量份，微晶纤维素20重量份、羧甲基淀粉钠20重量份、聚维酮K3tl 10重量份混合制粒，再将干颗粒按重量份2500 50的比例加入滑石粉混合均匀压片，再在压片表边喷雾涂覆肠溶薄膜衣层制成。上述药物的用量一般为0. 2-6. 4mg CZLC331蛋白/kg体重，每天给药1-2次，疗程为5至10天。注射液可经肌肉注射、腹腔注射或静脉注射给药。本专利技术提供了沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白在炎症性肠病药物研发中的新用途。通过给予小鼠三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid,TNBS)灌肠以模拟人溃疡性结肠炎实验发现，沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白对炎症性肠病具有明显的预防和治疗作用，具体表现为1)造模组小鼠摄食/饮水量明显减少，活动减少并伴有便血，结肠出现肉眼可见的的充血、水肿、出血及溃疡、显微镜下可见细胞结构紊舌L、杯状细胞消失、淋巴细胞和中性粒细胞浸润等；(2)腹腔给药后小鼠摄食/饮水量恢复正常、活动明显增加且便血减少，结肠肉眼可见的充血、水肿、出血及溃疡等现象明显减轻， 显微镜下可见的细胞结构紊乱和杯状细胞消失、淋巴细胞和中性粒细胞浸润现象明显减轻等。上述实验结果表明腹腔注射CZLC331蛋白可以有效对抗结肠炎症对肠粘膜的损伤，并对炎症条件下的小鼠起到保护作用。因而，可以沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白为活本文档来自技高网...

【技术保护点】
沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白在防治炎症性肠病药物研发中的应用。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：张成岗，徐阳，吴永红，李伟光，李军怀，张艳春，高艳，李志慧，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所，苏州科景生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：