钠/钾三磷酸腺苷酶及胆固醇相关的材料和方法技术

本发明专利技术部分基于钠/钾三磷酸腺苷合成酶(Na/K?ATPase)的新结构构象及功能的阐明,尤其是对新的结合位点及相互作用的阐明。本发明专利技术提供了Na/K?ATPase及与Na/K?ATPase相互作用的化合物之间的数种惊人的结构及功能关系的应用。这些结构和关系的公开提供了对在化学上影响Na/K?ATPase相互作用以及已知的其上游和下游的调节子的理解及解决方案。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及生物学、化学及医学领域。本专利技术具体涉及与心血管疾病相关的离子转运蛋白质、小的药物活性分子、研究工具、诊断学、试剂盒及处理方法。影响胆固醇介导的心血管疾病的强心类固醇拮抗剂及组合物在本专利
内。其他领域，如物理学及生物化学也为本专利技术提供了框架。
技术介绍
本专利技术部分基于对钠/钾三磷酸腺苷合成酶(Na/K ATPase)的新结构构象及功能的阐明，尤其是对新的结合位点及相互作用的阐明。本专利技术提供了 Na/K ATPase及与Na/KATPase相互作用的化合物之间的惊人的结构及功能关系的应用。本专利技术提供了解决方案，其在化学上影响了 Na/K ATPase相互作用以及已知的上游和下游的调节子。Na/K-ATPase起初是作为位于质膜内的活性离子转运子发现的。功能性的Na/K-ATPase主要是由α和β亚基构成。α亚基为催化亚基，因为其包含配体及核苷酸结合位点。尽管其长期以离子转运子为人所知，近期的研究表明Na/K-ATPase除了其离子泵功能外，还能够进行多种其他功能。例如,发现Na/K-ATPase与Src激酶相互作用，形成功能性信号传导复合物，能够将细胞外信号转导进入而激活细胞内激酶级联。有趣的是，证明了进行信号传导的Na/K-ATPase主要位于专门的质膜微结构域(称为穴样内陷(“小窝”))并与穴样内陷标记物——窖蛋白-I蛋白质相互作用。窖蛋白-I蛋白质是一种 22-kD蛋白质，主要位于质膜中。除了其在穴样内陷的生物形成中的作用外，已知其在细胞胆固醇体内平衡中起作用。已经证明其与胆固醇以1:1的比率相结合，并参与胆固醇在质膜和细胞内细胞器之间的运输。进一步地，细胞胆固醇的耗尽使得窖蛋白-I重新分配至核周区域。在另一方面，Na/K-ATPase调控窖蛋白-I的细胞膜运输。Na/K-ATPase α I的梯度敲除导致窖蛋白-I在穴样内陷结构域内移动，并使得窖蛋白-I重新分配至核周区域。细胞胆固醇的耗尽使得Na/K-ATPase α I重新分配到穴样内陷之外。专利技术概述在其他广泛的实施方式中，提供了鉴定能够调制细胞内胆固醇浓度的测试组合物的方法，包括a.在胆固醇运输测试模型中将测试组合物与Na/K ATPase相接触；以及b.鉴定步骤a.是否产生细胞内胆固醇浓度的调制。还提供了鉴定能够调制质膜胆固醇浓度的测试组合物的方法，包括a.在胆固醇运输测试模型中将测试组合物与Na/K ATPase相接触；以及b.鉴定步骤a.是否产生细胞内胆固醇浓度的调制。优选的是上述权利要求的任何项，其中调制为细胞内胆固醇浓度的降低，其中测试模型为细胞培养物，其中测试模型为哺乳动物的，其中测试模型选自肝细胞；肾细胞；脑细胞；神经细胞；胰腺细胞；肺细胞；皮肤细胞；心脏细胞；啮齿动物细胞；人细胞；小鼠；大鼠；豚鼠；猴；以及人，其中测试模型选自以下的测试模型=NPCl病；病理性脂质积累；脉管疾病；心脏病；中风；超重；肥胖；糖尿病；代谢综合征；甲状腺功能紊乱；药物副作用；关节硬化；心力衰竭；心脏疾病；阿尔茨海默病；帕金森病；亨廷顿病；泰萨二氏病；以及神经退行性疾病。·还提供了鉴定能够调制胆固醇浓度的测试组合物的方法，包括a.将测试组合物与Na/K ATPase相接触；以及b.鉴定步骤a.是否产生对Na/K ATPase的α I亚基的CRAC结构域的结合。优选的那些方法中，步骤a.是以选自体外和体内的形式完成的。还提供了影响细胞中胆固醇转运的方法，包括影响Na/K ATPase的胆固醇结合活性。优选的是那些方法，其中Na/K ATPase的胆固醇结合活性以以下方式受到影响降低；增加；消除；阶段性破坏；以及阶段性增强。还提供了在需要这种改善的器官中改善由于病理性细胞内胆固醇累积导致的神经退行的方法,包括降低Na/K ATPase的胆固醇结合活性。还提供了治疗Cl型Neumann Pick病的方法,包括专门降低Na/K ATPase结合胆固醇的能力，其中降低是以选自以下的方式完成的拮抗Na/K ATPase的α I亚基的CRAC结构域；以及抑制Na/K ATPase的α I亚基的CRAC结构域。还提供了鉴定能够治疗胆固醇相关疾病状态的组合物的方法，包括a.将测试组合物与Na/K ATPase相接触；以及b.鉴定步骤a.是否产生对胆固醇结合Na/K ATPase的α I亚基的CRAC结构域的能力的拮抗。优选的是所描述的那些方法，其中疾病状态选自NPCl ;病理性脂质积累；脉管疾病；心脏病；中风；超重；肥胖；糖尿病；代谢综合征；甲状腺功能紊乱；药物副作用；关节硬化 ’心力衰竭;心脏疾病；阿尔茨海默病；帕金森病；亨廷顿病；泰萨二氏病；以及神经退行性疾病。还提供了在胆固醇运输测试模型中下调Na/K ATPase的方法，包括在测试模型中耗尽质膜胆固醇浓度。还提供了在胆固醇运输测试模型中将Na/K ATPase的α I亚基重新分配到细胞内区室的方法，包括在测试模型中耗尽质膜胆固醇浓度。还提供了在胆固醇运输测试模型中影响窖蛋白-I的运输和表达的方法，包括下调质膜的Na/K ATPase的α I亚基。还提供了治疗NPCl病的方法，包括改变Na/K ATPase的α I亚基的表达，以改善NPCl病的症状。本领域技术人员在参考附随的图示并阅读以下优选实施方式的详述本专利技术的多个方面后将清楚本专利技术的多个方面。附图简述本专利或申请文件可以包含一个或多个彩色图片及/或一张或多张照片。带有彩色图片及/或照片的本专利或专利申请出版物的副本将由美国专利商标局在收到请求及必要的支付费用时进行提供。图I. Μβ -⑶引起的膜胆固醇的急性耗尽下调了 Na/K-ATPase α I。在无血清培养基中用IOmM M β-⑶处理LLC-PKl细胞，在37°C进行lh，洗涤，并在洗涤后的细胞于无血清培养基中培养0、6和24h后收集细胞。附图说明图1A.测量不同时间点的细胞裂解物中胆固醇含量，根据蛋白质水平进行调整并比较。图1B.代表性的Western印迹显示了 Na/K-ATPase α I、胰岛素受体β亚基及α-微管蛋白(用作上样对照)的水平。结合四次独立的实验得出定量数据，表示为平均值土SE. *，Ρ〈0. 05。图1C.显示了未处理细胞及Μβ-⑶处理的细胞中Na/K-ATPase α I的细胞内分布的代表性共聚焦图像。图2.慢性胆固醇耗尽下调了 Na/K-ATPase α I。将LLC-PK1细胞在含有10%FBS(对照)或10%无血清或10%无脂蛋白FBS的DMEM中培养48h，裂解并测量α I亚基以及α -微管蛋白，如图2Α的图所示，胆固醇情况在图2Β中显示。结合四次独立的实验得出定量数据，表示为平均值土 SE. *，Ρ〈0. 05。图3.化合物U18666A耗尽质膜胆固醇并特异性下调Na/K-ATPase α I。图3Α.将LLC-PKl细胞以不同剂量的U18666A处理24h，然后进行菲律宾菌素处理(上图)及α I免疫染色(下图)。代表性的图片显示了 U18666A化合物对胆固醇及Na/K-ATPase α I的细胞分配的剂量依赖性影响。图3Β.三次独立实验的代表性Western印迹显示了细胞处理48h后，U18666A对Na/K-ATPase α 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢子建，陈逸良，王浩杰，
申请(专利权)人：托莱多大学，
类型：
国别省市：