本发明专利技术发现耐辐射异球菌Deinococcus?radiodurans?R1中的HIN蛋白基因(DR1372)具有增强原核生物及植物的抗逆能力。本发明专利技术构建了包含上述基因的重组载体，把它们分别导入原核及真核宿主细胞。实验证明，HIN蛋白基因(DR1372)在原核宿主细胞和植物中表达后，均能增强其耐盐抗性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及耐福射异常球菌Rl (Deinococcus radiodurans Rl)HIN蛋白基因(DR1372，GeneID =1798946)的新功能，具体涉及该基因增强植物对盐胁迫抗性方面的应用。
技术介绍
盐碱、干旱和冻害是限制植物生长发育的重要逆境因子，在胁迫过程中植物体会诱导合成一系列的功能蛋白，以保护植物体细胞在胁迫条件下免受伤害(Shinozaki,2007)。大量研究表明，HIN蛋白在植物抵御高盐等非生物胁迫的过程中发挥着重要作用。D. radiodurans Rl含有的HIN蛋白基因DR1372编码的蛋白属于LEA2家族成员，对胚乳发育和植物生长器官的渗透胁迫有保护作用(Campbell et al.，1997 ;Close et al. , 1997 ；Brawley et al. , 1998 ；Mtwisha et al. ,1998)。 但目前未见耐辐射异常球菌Rl HIN蛋白基因(DR1372，GeneID :1798946)在提高植物耐盐性方面的功能的研究报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是从D. radiodurans Rl基因组中发现能够提高植物对盐抗性的基因。并将该基因转入植物，使转入该基因的植物获得耐盐的能力。本专利技术通过如下研究发现，Deinococcus radiodurans Rl的HIN蛋白基因(DR1372)具有耐盐胁迫的功能，可用于培育耐盐性状的植物I、获得含有H radiodurans Rl HIN蛋白基因(DR1372)的重组工程菌株I)通过 PCR 从 D. radiodurans Rl (DSM 20539)菌株基因组扩增出 D. radioduransRl HIN蛋白基因(DR1372)，基因序列号为=GeneID :1798946。其大小为495 bp，该基因编码164个氨基酸，将其克隆于载体pGEMT-easy上，构建了含有完整HIN蛋白基因的重组质粒 pGEMT-hin ；2)将HIN蛋白基因(DR1372)连接于pRADZ3穿梭质粒上，该质粒含有能在大肠杆菌和耐辐射异球菌中都起作用的groEL启动子，构建含有groEL启动子的完整HIN蛋白基因(DR1372)重组质粒 pRADZ3-hin G ；3)将导入HIN蛋白基因(DR1372)的重组质粒pRADZ3_hin G转入受体大肠杆菌JM109中，获得重组菌株JM-hin (详见实施例I)；2、含有HIN蛋白基因工程菌株的耐盐实验实验证实，经4M NaCl盐溶液冲击后，含有D. radiodurans Rl HIN蛋白基因(DR1372)的JM-hin重组菌株生长状况良好，菌落数高于只含空质粒的JM-Z3菌株(见实施例2及图4)。该工程菌株具有耐受4M NaCl冲击的能力。此实验表明D. radiodurans Rl HIN蛋白基因(DR1372)具有增强原核生物耐盐的能力。3、HIN蛋白基因(DR1372)在油菜中表达及转基因植株的耐盐性鉴定I)将D. radiodurans Rl HIN蛋白基因(DR1372)连接到植物表达载体pBI121中，构建具有HIN蛋白基因(DR1372)的重组质粒pBI121_hin ;2)将pBI121_hin重组质粒转化油菜中，获得了能够耐受盐胁迫的转基因油菜植株; 此实验表明D. radiodurans Rl HIN蛋白基因(DR1372)具有培育耐盐植物的用途(见实施例3)。附图说明图I是含有D. radiodurans Rl HIN蛋白基因(DR1372)序列的PCR产物验证电泳图谱；图2是含有D. radiodurans Rl HIN蛋白基因(DR1372)及groEL启动子构建原核表达载体的验证电泳图谱；图3是在盐冲击试验前的含有空载体和含有D. radiodurans Rl HIN蛋白基因(DR1372)序列的原核表达载体的大肠杆菌的生长情况的菌落照片，其中a是含有空表达载体的大肠杆菌JM 109菌株；b是含有D. radiodurans Rl HIN蛋白基因(DR1372)表达载体的大肠杆菌重组菌株;图4是含有D. radiodurans Rl HIN蛋白基因(DR1372)的原核表达载体及空载体的大肠杆菌(E. coli)在含4M NaCl培养基中的生长情况的菌落照片，图中的菌株如下a是含有空表达载体的大肠杆菌JM109菌株；b是含有D. radiodurans Rl HIN蛋白基因(DR1372)表达载体的大肠杆菌重组菌株;图5是在350mmol. L 1的NaCl培养基上转D. radiodurans Rl HIN蛋白基因(DR1372)油菜与非转基因油菜的耐盐试验结果比较。图中顺序从左至右，左起第I盆是非转基因油菜，第2 5盆是转入D. radiodurans RlHIN 蛋白基因(DR1372)的油菜。具体实施方案以下实施例中所举的质粒、菌株只是用于对本专利技术作进一步详细说明，并不对本专利技术的实质内容加以限制。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(New York Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所举的质粒、菌株来源如下克隆载体pGEMT-easy :为Promrga公司市售产品；穿梭质粒pRADZ3 :为本实验室保存；植物表达载体pBI121 :为Clontech公司市售产品；大肠杆菌JM 109 :为北京全式金公司市售产品。农杆菌EHA 105由本实验室保存实施例I D. radiodurans Rl HIN蛋白基因(DR1372)序列在大肠杆菌中的表达根据已公布的D. radiodurans Rl基因组中的HIN蛋白基因(DR1372)序列设计I对PCR特异性引物，从D. radiodurans Rl基因组DNA中扩增完整的核苷酸序列Up 5' ATTA ACTAGT* GAGCTATGAAGAAGATGGCTTTTG3;；Down 5' ACGC CATATG TCCTCAAAACACCGATAAAG3;。上述黑斜体部分是酶切位点。通过PCR方法从D. radiodurans Rl的基因组中扩增出目的基因序列，反应条件940C IOmin, 30 个循环，72°C IOmin, PCR 产物经胶回收后，克隆于载体pGEMT-easy上，命名为pGEMT_hin，并测序验证；然后通过Spel/Ndel双酶切获得含有粘性末端的及含有启动子groEL的pRADZ3载体，将HIN蛋白基因(DR1372) 连接于PRADZ3载体上，构建大肠杆菌表达载体pRADZ3-hinG，将该表达载体转化大肠杆菌JM109，经PCR、酶切，测序验证插入序列正确(见图I，2)，将该重组菌株命名为JM-hin。将含有pRADZ3空质粒的E. coli JMl09命名为JM-Z3。实施例2含D. radiodurans Rl HIN蛋白基因(DR1372)重组菌株的耐盐实验一、实验方法I、将实施例I中获得的2个重组大肠杆菌分别接种于20mL LB液体培养基(含Amp抗生素本文档来自技高网...
【技术保护点】
Deinococcus？radiodurans？R1？HIN蛋白基因(DR1372，GeneID：1797273)培育耐盐植物的用途。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王劲，江世杰，张维，陈明，陈震，林敏，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。