一种卵黄囊和/或脂肪细胞的染色方法及其用途技术

本发明专利技术涉及一种卵黄囊和/或脂肪细胞的染色方法，特别是一种斑马鱼卵黄囊和/或脂肪细胞的染色方法，以及利用此方法构建的减肥药物筛选模型。具体地，在育有斑马鱼幼鱼的培养液中，加入脂肪染料，孵育，可以在显微镜下观察斑马鱼脂肪细胞的染色情况，并根据荧光强度的变化判断减肥药物的效果。本发明专利技术还涉及斑马鱼用于筛选减肥药物的用途。本发明专利技术的方法快速、直观、灵敏、高效，并且能进行高通量筛选，为减肥药物评价动物模型的构建提供了一条崭新的途径。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种卵黄囊和/或脂肪细胞的染色方法，特别是一种斑马鱼卵黄囊和/或脂肪细胞的染色方法，以及利用此方法构建的斑马鱼减肥药物筛选模型。
技术介绍
肥胖已经成为了人类健康的危险因素之一，随着物质生活条件的提高，肥胖病发病率逐年攀升。不仅影响体态和活动，而且容易引发高脂血症、动脉粥样硬化、高血压、冠心病、糖尿病等疾病。据不完全统计全世界人口中10%以上患有肥胖症，发展中国家尤为严重。我国城市人口中肥胖症人群已超过30%，北京已经超过40%，并且有扩大的趋势。所以预防和控制肥胖，已刻不容缓，开发减肥药物势在必行。减肥已成为了新型的医学课题。近年来减肥药物、减肥茶、减肥食品不断涌现，各种减肥研究如火如茶。但评价减肥药效的·动物模型十分匮乏，虽然有高脂饮食制作肥胖鼠模型和转基因鼠模型，但其是非自然状态下的，并且个体差异很大，重复性差，实验数据靠大量推断，误差很大。开发一种能够直观可见，实验结果不用大量推断就能判定的快速、直观、灵敏、高效、高通量的评价模型十分必要。斑马鱼是近年来发展起来的脊椎模式生物。斑马鱼以其独特的优势倍受关注。斑马鱼卵体透明，即使在发育的高级阶段，仍然可以观察到全部的细胞。荧光染色或使用其它标记物可使细胞系观察得更清楚。不仅能跟踪观察每个细胞的发育命运，也可观察到原肠期的细胞运动、脑区的形成和心跳等胚胎发育情况，同时发育异常的突变体也很容易被鉴别出来。胚胎发育时期，体型变化不大，全胚组织标本制作技术，及全胚原位杂交技术，都可以在胚胎上实施。由于胚胎在体外受精、体外发育，故可在母体外对胚胎进行独立操作。而一般使用的小鼠属于胎盘动物，胚胎操作时不能离开母体，实验分析时就需要大量推论，实验结果往往与实际存在一定差异。另外，斑马鱼的胚胎发育非常迅速(从受精到孵出大约3d)，而且来之于同一母体的胚胎是同步发育的，易于大量收集特定阶段的同期胚胎材料。因此斑马鱼具有其它生物无可比拟的优势，主要包括以下几个方面1.斑马鱼核苷酸序列分析基本完成，中枢神经系统、内脏器官、血液以及视觉系统在分子水平上与人有很高的同源性；2.疾病表达的相关基因与许多脊椎动物相同；3.全年产卵、体积小、产卵量大，作为胚胎发育模型有丰富的研究背景；4.使用斑马鱼胚对母体无任何影响，早期身体透明，可对发育过程直接观察；5.斑马鱼胚胎和幼鱼对药物非常敏感，极微量就会有反应，最小检出量在ng/L级；6.简便易行，只需将被检测物质放入养殖胚胎的水中或快速注射；用量很少；测试周期短；测试样本数可以很大，可以作为毒物药物的高通量筛选，以确保统计学意义上的显著性。为此，经济合作发展组织(0E⑶)将斑马鱼列为了健康毒性和环境毒性检测的标准鱼类(http://www. oecd. ovr/)。国际标准组织(ISO)已将斑马鱼推荐为河水毒性实验鱼种并制定了相应的标准(IS007346)。由于斑马鱼具有上述特性，如果将其用于药物筛选，会有很多优势，但目前尚未有相关报道。
技术实现思路
斑马鱼幼鱼的营养是由受精卵的卵黄囊提供的，卵黄囊内存在大量的脂肪。专利技术人意外地发现，通过脂肪染料就可以将其染色。将染料溶解于饲养斑马鱼幼鱼的溶液中共同孵育，可以观察其脂肪染色情况。由于上述发现，使得利用它来建立减肥动物模型成为可能，本专利技术即以此为基础完成。专利技术人经过大量的研究证实，在斑马鱼生活的水环境中，在不影响斑马鱼生存健康的情况下，利用荧光和/或其他脂肪染料标记和/或染色斑马鱼脂肪细胞，荧光清晰可见。将减肥药物按一定浓度梯度加入斑马鱼幼鱼饲养液中，观察荧光变化。当药物具有减肥作用时，荧光会减弱或消失，如果荧光没有变化证明没有减肥效果。具体地， 本专利技术的一个方面涉及一种斑马鱼卵黄囊和/或脂肪细胞的染色方法，其包括以下步骤I)在育有斑马鱼幼鱼的培养液中，加入脂肪染料，继续培养；任选地，在培养液中加入黑色素合成抑制剂，例如I-苯基-2-硫脲；2)任选地，在荧光显微镜下观察斑马鱼卵黄囊和/或脂肪细胞染色情况；任选地，在观察前将斑马鱼麻醉。本专利技术的另一方面涉及一种筛选减肥药物的方法，其包括以下步骤I)在育有斑马鱼幼鱼的培养液中，加入脂肪染料，继续培养；任选地，在培养液中加入黑色素合成抑制剂，例如I-苯基-2-硫脲；2)在I)的培养液中加入待测减肥药物，同时设立不加减肥药物的对照，继续培养；任选地，在培养液中加入黑色素合成抑制剂，例如I-苯基-2-硫脲；3)将斑马鱼取出，在荧光显微镜下观察卵黄囊和/或脂肪细胞染色情况；任选地，在观察前将斑马鱼麻醉；如果与对照相比，被染色的卵黄囊和/或脂肪细胞产生的荧光强度减弱或消失，则判定减肥药物有效。在本专利技术中，所述斑马鱼幼鱼的鱼龄为孵出后0天-15天，优选为0天-10天，例如为0天(即孵出后当天)、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。在本专利技术的一个实施方案中，为斑马鱼幼鱼孵出后0天。在本专利技术中，所述的加入脂肪染料后继续培养的时间为I天-5天，例如为I天-3天，具体地，例如为I天、2天或3天；在本专利技术的一个实施方案中，继续培养3天。在本专利技术中，加入减肥药物后所述的继续培养时间可以根据不同减肥药物调整，可以为I天-5天，例如为2天-4天，具体地，例如为2天、3天或4天；在本专利技术的一个实施方案中，继续培养3天。由于斑马鱼幼鱼的鱼龄在15天后，幼鱼体内会出现其它脂肪组织而干扰观察，因此在荧光显微镜下观察脂肪染色情况时，优选斑马鱼幼鱼的鱼龄小于等于15天。在本专利技术中，所述的脂肪染料是指能够对脂肪组织或细胞染色的物质，通常为脂溶性染料，其包括但不限于油红O、尼罗红、尼罗蓝和苏丹类，所述苏丹类染料选自苏丹III、苏丹IV和苏丹黑b;其用量可以根据不同的染料种类进行调整，可以为l-100ng/ml，例如为10-50ng/ml，如10、20、30、40或50ng/ml ;在本专利技术的实施方案中，所述的脂肪染料为油红0和尼罗红，其用量为l_50ng/ml，例如为20ng/ml。在本专利技术中，所述黑色素合成抑制剂可以抑制黑色素形成，例如可以通过抑制酪氨酸羟化酶抑制黑色素形成，例如I-苯基-2-硫脲或30%的双氧水。在本专利技术的一个实施方案中，所述黑色素合成抑制剂为I-苯基-2-硫脲。在本专利技术中，将I-苯基-2-硫脲溶解于0. 3XDanieau溶液或丙酮溶液中，以增加溶解度。其使用浓度为10_50mg/L，在本专利技术的实施方案中，其浓度为30mg/L。在本专利技术中，所述的在荧光显微镜下观察是指在明场或紫外光场下观察，或者将明场与紫外光场叠加观察。所述明场是指在荧光显微镜的普通光下观察，所述紫外光场是指在荧光显微镜的紫外光激发下观察，所述明场与紫外光场叠加是指普通光下观察图像与紫外光激发下观察图像的叠加。在本专利技术中，所述荧光强度减弱或消失，是指与未用减肥药物的对照相比，荧光强 度在目测条件下明显减弱或消失，或者通过计算为对照的50%以下，例如荧光强度为对照的 50%、40%、30%、20%、10%，或 5% 以下。其中荧光强度的计算方法为利用图像分析软件对荧光图像进行分析，并计算荧光强度，例如利用C⑶成像软件。在本专利技术的一个实施方案中，利用NIKON，NIS-Elements BR软件进行分析。本专利技术的另一方面涉及本专利技术的染色和观察方法用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种斑马鱼卵黄囊和/或脂肪细胞的染色方法，其包括以下步骤：1)在育有斑马鱼幼鱼的培养液中，加入脂肪染料，继续培养；任选地，同时加入黑色素合成抑制剂，例如1？苯基？2？硫脲；2)任选地，在荧光显微镜下观察斑马鱼卵黄囊和/或脂肪细胞染色情况；任选地，在观察前将斑马鱼麻醉。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵宝全，孙曼霁，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所，
类型：发明
国别省市：