甜瓜抗蔓枯病聚合基因的鉴定制造技术

本发明专利技术的甜瓜蔓枯病抗性基因聚合方法及其鉴定专用于甜瓜抗蔓枯病聚合抗源筛选以及抗蔓枯病标记辅助聚合育种研究。两个抗蔓枯病材料PI420145和PI482398杂交、后代连续自交得到抗蔓枯病基因稳定遗传的F4，F4聚合了PI420145和PI482398的抗蔓枯病基因，且聚合后抗源的聚合抗源的抗性增强，抗性高于亲本。PI420145和PI482398杂交及自交后代F4聚合双亲的蔓枯病抗性基因，该抗源的蔓枯病抗性基因与AFLP标记EcoRI-TG/MseI-CTC200，EcoRI-AT/MseI-CTG90，EcoRI-TC/MseI-CAG60连锁，同时SSR标记CMAT170a连锁。通过本发明专利技术提供的甜瓜蔓枯病抗性基因聚合及其鉴定方法，获得聚合基因材料，其抗性高于单一抗源，大大提高抗蔓枯病甜瓜的选择效率，在甜瓜抗蔓枯病育种中，该聚合抗源可做为供体亲本，能够加速甜瓜抗蔓枯病育种进程。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术公开了甜瓜抗蔓枯病聚合基因鉴定的方法，专用于甜瓜抗蔓枯病聚合育种及分子标记辅助选择，有利于开展甜瓜蔓枯病抗病品种的选育与种质资源的创制，属于植物生物

技术介绍
在甜瓜抗蔓枯病研究领域，国际上发现含有不同抗性基因的5份抗源材料PI140471、PI157082、PI511890、PI482398 和 PI482399,其抗性基因分别命名为 Gsb-UGsb-2、Gsb-3、Gsb-4和Gsb_5。PI420145是最新筛选出的蔓枯病抗源，通过遗传分析，该抗源的抗性基因也为单显性。这6份抗源的蔓枯病抗性均由单个基因控制，但是随着栽培环境的和病原物致病性的改变，携带单个抗蔓枯病基因的抗源已不能提供足够的、稳定的抗病性。多个抗性基因聚合后，并不简单的表现为单个抗病基因的抗谱之间的简单累加，而是 抗性基因之间表现为基因互作，这样能够扩大抗谱，增加抗源的抗性。因此，在进行甜瓜蔓枯病抗性育种时将多个抗蔓枯病基因同时导入改良亲本，是获得持久、高抗蔓枯病甜瓜品种的重要途径之一。可通过两份抗蔓枯病材料常规杂交将抗性基因聚合到一份抗源中、连续自交多代稳定抗性，实现抗蔓枯病基因的聚合。在聚合的过程中，运用表型结合分子标记技术辅助选择，分子标记辅助选择通过分析与目标基因紧密连锁的分子标记鉴别目标基因是否存在，不受基因表达、环境条件及植株生长发育阶段的影响，也不受杂交方式的影响，在植株的苗期或低世代就可进行筛选，可以缩短选择年限，提高育种效率。
技术实现思路
技术问题本专利技术甜瓜蔓枯病抗性基因聚合鉴定，目的是针对单一抗源抗性基因抗性不足，不持久等缺点，发掘出甜瓜蔓枯病聚合抗病基因资源，为甜瓜的蔓枯病抗病育种提供基因资源和标记辅助选择的技术，从而大大提高选择效率。将不同的抗性基因聚合在同一品种中可以提高抗性，拓宽抗谱，达到持久抗性的目的，加快培育优良抗蔓枯病甜瓜品系的进程。技术方案以抗蔓枯病材料PI 420145作为母本，与另一抗蔓枯病材料PI482398进行杂交，得到F1, F1自交，每代经蔓枯病菌抗性鉴定选出抗蔓枯病植株连续自交三代得到F4, F4经人工接种抗性鉴定，筛选抗蔓枯病遗传稳定的植株。对F4抗蔓枯病甜瓜植株进行抗性基因鉴定。用3个AFLP分子标记对抗病材料PI420145、感病材料白皮脆以及40份F4材料进行PCR扩增，结果表明，PI420145和40份F4材料中在200、90、60bp处均扩增出一条特异条带，与这3个引物在抗病材料PI420145上扩增的特异的条带完全完全一致，表明F4含有PI420145的抗蔓枯病基因，感病对照白皮脆未检测出该特异条带。用SSR标记CMAT170a对抗病材料PI482398、感病材料白皮脆以及40份F4材料进行PCR扩增，PI482398和40份F4材料在120bp处均扩增出一条特异条带，与该引物在抗病材料PI482398上扩增的特异条带一致，表明F4含有抗蔓枯病基因Gsb_4，感病对照白皮脆未检测出这些条带。则这40份F4材料聚合了 PI420145和PI482398抗蔓枯病基因。有益效果本专利技术所提供的甜瓜抗蔓枯病基因聚合方法及其鉴定具有以下优点I)本专利技术通过2个甜瓜抗蔓枯病材料PI420145和PI 482398杂交和连续自交三代，得到F4，获得甜瓜2个抗蔓枯病基因聚合的材料，其抗性稳定，且抗性大于单一抗源。2)本专利技术创制的甜瓜抗蔓枯病基因聚合材料F4，可作为抗性亲本进行抗病育种，通过与性状优良的商品种杂交、回交，获得抗蔓枯病的优异甜瓜品种。对甜瓜抗蔓枯病育种及种质创新具有重要意义。·四附图说明图I :SSR引物CMAT170a在抗源PI482398、白皮脆和聚合抗源后代F4上扩增的结果表明聚合抗源后代F4中含有抗源PI482398的抗蔓枯病基因。其中，M:Marker，l :抗蔓枯病单株PI482398，2 :感蔓枯病单株白皮脆，3 :聚合抗源PI420145XPI482398。箭头示为出现的特异带。图 2 =AFLP 引物 EcoRI-TG/MseI-CTC200，EcoRI-AT/MseI-CTG90，EcoRI-TC/MseI-CAG60在抗源PI420145、白皮脆和聚合抗源后代匕上的扩增结果表明后代F4中含有抗源PI420145的抗蔓枯病基因。 其中，I:抗蔓枯病单株PI420145 ;2:感蔓枯病单株白皮脆；3:聚合抗源PI420145XPI482398。 箭头示为出现的特异带。 五具体实施例方式本专利技术甜瓜抗蔓枯病基因聚合及分子标记鉴定的实施程序包括(I)将抗源PI420145(早)和抗源PI482398( ^ )进行杂交，对杂交后代F1进行田间接种鉴定，筛选抗性植株自交，对自交后代进行蔓枯病菌接种鉴定，筛选出抗病植株，连续自交3代，得到抗蔓枯病后代F4，对F4接种鉴定筛选抗性植株，取幼嫩叶片，用CTAB法提取DNA，进而用AFLP和SSR标记鉴定蔓枯病抗性基因。(2)抗蔓枯病菌鉴定抗源PI420145、PI482398、感病材料白皮脆和后代匕人工接种鉴定，其发病率和病情指数如下表I :表I抗蔓枯病接种鉴定权利要求1.甜瓜抗蔓枯病聚合基因材料创制方法 通过抗蔓枯病材料PI 420145作为母本与父本抗蔓枯病材料PI482398(Gsb-4)进行杂交，自交，室内PCR鉴定，田间抗性筛选和农艺性状选择，连续自交三代得到F4，在F4中筛选出PI 420145和PI482398抗蔓枯病基因聚合的纯合株系。2.PI 420145、PI482398抗蔓枯病基因分子标记定位 已筛选出 3 个 AFLP 分子标记 EcoRI-TG/MseI-CTC200, EcoRI-AT/MseI_CTG90，EcoRI-TC/MseI-CAG60与PI420145的抗蔓枯病基因连锁；筛选到一个SSR标记与PI482398的抗蔓枯病基因连锁，该标记为CMAT170a，用该SSR标记能扩增出长度约为120bp的DNA片段。3.甜瓜PI420145 X PI482398 F4抗蔓枯病基因聚合，其特征在于 PI420145、PI482398蔓枯病抗基因均为单显性。PI420145XPI482398的自交后代F4 聚合了 PI420145 和 PI482398 抗蔓枯病基因，三个 AFLP 标记 EcoRI-TG/MseI_CTC200，EcoRI-AT/MseI-CTG90，EcoRI-TC/MseI-CAG60，在 F4 和 PI420145 上分别扩增出相同大小的特异片段。SSR标记CMAT170a在F4和PI482398上均扩增出长度大小约为120bp的特异片段。回收AFLP和SSR特异条带，克隆测序，F4上扩增出的特异片段与在PI 420145,PI482398上扩增出的特异片段大小、序列均相同。全文摘要本专利技术的甜瓜蔓枯病抗性基因聚合方法及其鉴定专用于甜瓜抗蔓枯病聚合抗源筛选以及抗蔓枯病标记辅助聚合育种研究。两个抗蔓枯病材料PI420145和PI482398杂交、后代连续自交得到抗蔓枯病基因稳定遗传的F4，F4聚合了PI420145和PI482398的抗蔓枯病基因，且聚合后抗源的聚合抗源的抗性增强，抗性高于亲本。PI420145和PI482398杂交及本文档来自技高网...

【技术保护点】
甜瓜抗蔓枯病聚合基因材料创制方法：通过抗蔓枯病材料PI？420145作为母本与父本抗蔓枯病材料PI482398(Gsb？4)进行杂交，自交，室内PCR鉴定，田间抗性筛选和农艺性状选择，连续自交三代得到F4，在F4中筛选出PI？420145和PI482398抗蔓枯病基因聚合的纯合株系。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈劲枫，徐兵划，钱春桃，娄群峰，王红英，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：