本发明专利技术提供一种伴随竞争性杂交的碱基序列的识别方法,该方法在保持识别碱基序列差异的精度的同时,可在与现有方法相比非常短的时间内识别具有目标碱基序列的核酸。本发明专利技术的目标碱基序列的识别方法,具有下述工序:热变性工序,其将试样双链核酸和含有与目标碱基序列相同的碱基序列的标准双链核酸在单反应液内进行热变性处理;降温工序,其在上述热变性工序之后,通过使上述反应液的温度降低,从而在上述试样双链核酸和上述标准双链核酸中进行竞争性杂交;测定工序,其对由构成上述标准双链核酸的核酸链和构成上述试样双链核酸的核酸链形成的双链核酸进行测定;和识别工序,其基于通过上述测定工序得到的测定结果,识别上述标准双链核酸与上述试样双链核酸的同一性。并且,上述降温工序在阳离子性梳型聚合物的存在下进行。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种识别试样所含的核酸是否为具有目标碱基序列的核酸的方法,更详细地说,涉及一种在竞争性杂交中可改善核酸识别性和缩短反应时间的方法。本申请基于2010年3月29日向日本提交的日本特愿2010-075297号要求优先权,将其内容援用于此。
技术介绍
通过人类基因组的解读、特别是通过制作SNP (Single Nucleotide Polymorphism,单核苷酸多态性)图谱的国际人类基因组单体型图计划,有关人类基因组的信息日趋增加。而且,在全世界范围内已经大规模开展以实现下述“对应于个人遗传信息的医疗”(量身定制式医疗)作为目标的研究通过发现所获得的基因组信息与个人体质之间的关联,掌握基因水平上的个人体质差别,可对应于个人特性进行疾病诊断、治疗、预防或施药。这里的基因差别意味着每个人的基因组碱基序列上的差别,其主要差别是一个碱基的差别(SNP)。另外,最近,已了解短碱基序列的重复次数(拷贝数)的差别(拷贝数变异(Copy Number variation :CNV))也广泛存在于全基因组中,并指出了该CNV的差别与疾病之间的关联性。在此,为了掌握个人在基因水平上的差别,有必要调查每个人的基因型。例如,已知在某SNP中,其基因型为AA、AG、GG三种。A表示腺嘌呤、G表示鸟嘌呤碱基,该SNP是基因组位置有腺嘌呤的情形和鸟嘌呤的情形的一个例子。因此,为识别该SNP的基因型的检查,就是要确定是该三种基因型中的哪一种。即,只要发现A是O和100中的哪一个、G是O和100中的哪一个或者A和G是否为50和50即可。如此,SNP等的生殖细胞系列突变的检测,基本可以说是定性的检测,该方法是较容易的,各种简便的方法得到实用化。另一方面,在癌细胞中,在体细胞水平上发生突变并且该突变成为癌的诱因而与异常增殖有关。因此,在某特定种类的癌细胞中,有时会出现特定基因的突变,可以将该突变作为指标进行癌细胞的检测。但是,癌细胞富有多样性,根据一种突变来确定癌细胞未必是容易的。另外,在最近的药物疗法中,开发了以生物体内特定的分子(蛋白质等)作为目标的药剂,且发现了副作用少、效果高的药剂。它们被称作分子靶向药物,主要在癌治疗领域中得到积极的开发。极其最近,明确了在这些分子靶向药物中,当作为靶目标的分子的信号传递的下游蛋白质中发生突变时,则该药剂的效果得不到发挥等。此时,通过调查对发生了突变的蛋白质进行编码的基因的突变,可以预测该药剂的效果,不断开拓与SNP检测不同的新型“量身定制式医疗”的领域。在此所述的癌细胞中的特征性突变或者对分子靶向药物显示抵抗性的突变,几乎都是体细胞突变。在前述的生殖细胞系列突变时在所有细胞中均发现相同的突变,与此相对,在体细胞突变中只在引起突变的细胞中发现突变,在未引起突变的细胞(通常为正常细胞)中未发现突变。因此,通常在标本(作为检查对象的试样)中处于突变细胞和正常细胞相混合的状态,对应于这些细胞的丰度比(abundance ratio),存在有突变基因和正常基因。S卩,若试样的大部分是正常细胞而含有部分突变细胞,则不得不从大量正常基因中检测出所存在的少许突变基因,而这就是体细胞的基因突变检测与生殖细胞中的突变检测的不同点,使体细胞的基因突变检测变得更加困难。在体细胞的基因突变检测法中,大致分为两种方法。其中,一种是在检测过程的基因扩增阶段区别正常基因和突变基因的方法,具体而言,是只对突变基因进行特异性扩增的方法。例如,作为灵敏度最好的方法,是用限制酶只对正常基因进行切割并只对未切割的突变基因进行扩增的、被称作“突变体富集PCR (mutant-enriched PCR)的方法(例如,参照非专利文献I)。在该方法中,通过反复进行扩增突变基因的反应,可以从正常基因IO6分子中检测出I分子的突变基因(例如,参照非专利文献2)。该方法在这种所谓高灵敏度的方面优良,但操作非常繁杂,并不是可以适用于通常的诊断中的方法。 另外,开发了一种在PCR等的引物的延伸反应中通过区分一个碱基的差别进行扩增的方法。该方法是被称作“ARMS(amplification refractory mutation system,扩增抑制突变系统)”(例如,参照非专利文献3)、或“ASPCR (allele specific PCR,等位基因特性PCR)”(例如,参照非专利文献4)等的方法。该方法是一种优异的方法,灵敏度较高,不需要再进行除通常PCR扩增反应以外的操作,可以在封闭系统中进行全部反应,所以非常简便,不存在PCR遗留污染。然而,但凡有一次错误识别一个碱基而进行了正常基因的扩增时,则在此后的扩增反应中,也会与扩增突变基因同样地扩增正常基因,因此,也可以称作一种假阳性危险高的方法。当采用该方法时,需要严格控制反应条件(即,反应温度、盐浓度等),并且模板量也需要严格相同(例如,参照非专利文献5),因此对检查非特定多数的标本的临床检查或者要求高精度的诊断中并不适合采用。另一种检测体细胞的基因突变的方法,是在检测过程中同时扩增突变基因和正常基因后通过区别突变基因和正常基因来进行检测的方法。作为通过区别所扩增的突变基因和正常基因进行检测的方法,有利用电泳的方法、利用杂交的各种方法(例如,参照非专利文献5)。然而,在大部分方法中,很难以良好的精度检测出包含在大量正常基因中的少量突变基因。例如,作为被称作突变基因检测的金标准(go I d s tandar d )的方法,有双脱氧测序法(dideoxy sequencing)。尽管双脱氧测序法能够以较高灵敏度检测突变基因,但当突变基因和正常基因混在时,突变基因的检测灵敏度为10%左右,作为实际检查所希望的灵敏度是不充分的。除此之外,已有报道,在焦磷酸测序法中,可以提高检测灵敏度至5%左右,优于双脱氧测序法(例如,参照非专利文献6)。另外,正在开发下述方法将含有突变的序列通过PCR进行扩增,求出其生成物的双链DNA的解链曲线,根据突变基因和正常基因的解链曲线的差别求出突变基因的比例。在该方法中,可检测正常基因中所含的突变基因达到5%左右(例如,参照非专利文献7)。例如,报道了一种通过精确控制严格性来检测I个核苷酸的差异的方法(例如,参照非专利文献8)。该方法利用了,与低聚核苷酸探针和目标序列完全互补时(全匹配)相t匕,包含探针与目标序列即使一个碱基不互补的碱基对时(不匹配)的缔合体的熔解温度降低。该方法也被利用于DNA芯片等,但一个碱基的识别性受到探针的碱基序列等的较大影响,或者需要非常严格的温度控制等,向临床诊断的应用未必容易。除此之外,作为严格区分一个碱基的差别的方法,还开发了利用具有相同碱基序列的双链之间的竞争性杂交的PCR-PHFA法。PCR-PHFA法是若作为基因型识别对象的试样(双链核酸)和已知序列的标准双链核酸之间的碱基序列完全相同,则不能对各链进行区另O,并且通过杂交而发生链的重组(链置换),但在样品和标准双链核酸之间只要一个碱基有差别,则通过竞争性杂交而在具有完全互补的碱基序列的链相互之间优先形成双链,因此,在试样与标准双链核酸之间不发生链的重组,PCR-PHFA法是利用该现象的突变检测法。已有报道通过使用该PCR-PHFA法,能够以1%左右的高灵敏度从本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.03.29 JP 2010-0752971.ー种目标碱基序列的识别方法,其识别目标碱基序列法,其特征在于,具有下述エ序: 热变性エ序,该热变性エ序将试样双链核酸和含有与目标碱基序列相同的碱基序列的标准双链核酸在单反应液内进行热变性处理; 降温エ序,该降温エ序上述热变性エ序之后,通过使上述反应液的温度降低,从而在上述试样双链核酸和上述标准双链核酸中进行竞争性杂交; 测定エ序,该测定エ序对由构成上述标准双链核酸的核酸链和构成上述试样双链核酸的核酸链形成的双链核酸进行测定;和 识别エ序,该识别エ序基于通过上述测定エ序得到的測定結果,识别上述标准双链核酸与上述试样双链核酸的同一性, 并且,上述降温エ序在阳离子性梳型聚合物的存在下进行。2.如权利要求I所述的目标碱基序列的识别方法,其特征在于,所述阳离子性梳型聚合物具有作为含有阳离子性基团的高分子链的主链和作为亲水性基团的侧链。3.如权利要求2所述的目标碱基序列的识别方法,其特征在于,所述阳离子性梳型聚合物的主链为聚赖氨酸。4.如权利要求2或3所述的目标碱基序列的识别方法,其特征在于,所述阳离子性梳型聚合物的侧链为葡聚糖。5.如权利要求2 4中任一项所述的目标碱基序列的识别方法,其特征在于,所述阳离子性梳型聚合物的主链含有胍基。6.如权利要求2 5中任一项所述的目标碱基序列的识别方法,其特征在于,所述阳离子性梳型聚合物的主链部分的分子量为5000以上。7.如权利要求I 6中任一项所述的目标碱基序列的识别方法,其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员:北野史朗,山根明男,丸山厚,
申请(专利权)人:凸版印刷株式会社,国立大学法人九州大学,
类型:
国别省市: