质量标记物制造技术

提供了一组两种或多种质量标记物，组中各质量标记物包含通过可断裂的连接物连接于质量归一化部分的质量指示部分，该质量指示部分具有抗碎裂性，其中，组中各标记物的聚集质量可以相同或不同，组中各标记物的质量指示部分的质量可相同或不同，其中，在组中具有共同质量的质量指示部分的标记物的任何组合中，各标记物具有与该组合中的所有其它标记物不同的聚集质量，并且，在组中具有共同的聚集质量的标记物的任何组合中，各标记物具有其质量不同于该组合中所有其它质量指示部分的质量的质量指示部分，这样组中所有的质量标记物可由质谱法得以相互区分。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用于标记分析物(具体是生物分子如核酸和蛋白质)的有用的化合物。具体而言，本专利技术涉及采用质谱法使用特殊的质量标记物进行分析的方法。
技术介绍
标记感兴趣的分子的各种方法在本领域中是已知的，包括放射性原子、荧光染料、发光试剂、电子俘获剂和光吸收染料。这些标记系统的每ー种都具有使其适合于某些应用而非其它应用的特征。由于安全原因，对非放射性标记系统的兴趣已导致荧光标记方案的 广泛的商业发展，尤其是用于遗传分析的荧光标记。荧光标记方案使得相对少量的分子能同时进行标记，通常可同时使用4种标记物，也可能达到8种。但是，检测装置的成本和分析所产生的信号的难度限制了可在荧光检测方案中同时使用的标记物的数量。最近，在质谱法领域中已开发了一种检测可断裂地连接于它们相关的感兴趣分子的标记物的方法。在许多分子生物学应用中，人们需要能在分析之前分离出感兴趣的分子。通常进行液相分离。近年来，质谱法已发展了许多用于液相分离的界面，这使得质谱法可特别有效地用作这些应用的检测系统。直到最近才采用液相色谱质谱法直接检测分析物离子或它们的片段离子。但是，对于许多应用，如核酸分析，分析物的结构可从间接的标记而得以确定。这尤其对于采用质谱法是有利的，因为复杂的生物分子(如DNA)具有复杂的质谱，并且其检测具有相对差的敏感性。间接检测指可使用相关的标记物分子来鉴别原始的分析物，该标记物被设计用于敏感性检测，并具有简单的质谱。简单的质谱使得可同时使用多种标记物分析大量的分析物。PCT/GB98/00127描述了共价连接于可断裂的标记物的核酸探针的阵列，所述标记物可采用质谱法检测到，该方法可鉴别共价连接的核酸探针的序列。此申请中的标记的探针具有Nu-L-M的结构，其中Nu是共价连接于L的核酸，L是可断裂的连接物，它共价连接于M，M是质量标记物。在此应用中，较佳的可断裂的连接物在质谱仪的离子源中断裂。此申请公开了多种离子化方法和使用四极质量分析仪、飞行时间(Time of flight,T0F)分析仪和磁性扇形场仪器进行的分析，将它们作为采用质谱法分析质量标记物的特殊方法。PCT/GB94/01675公开了可断裂地连接于质量标记分子的配体和特殊的核酸。较佳的可断裂连接物是光可断裂的。此申请公开了基质辅助的激光解吸电离(MALDI)TOF质谱法作为采用质谱法分析质量标记物的特殊方法。PCT/US97/22639公开了可释放的非挥发性质量标记物分子。在优选的实施方式中，这些标记物含有聚合物，通常是生物聚合物，这些聚合物可断裂地连接于反应性基团或配体(即探针)。优选的可断裂的连接物似乎在化学上和酶学上是可断裂的。此申请公开了 MALDI TOF质谱法作为采用质谱法分析质量标记物的特殊方法。PCT/US97/01070、PCT/US97/01046 和 PCT/US97/01304 公开了可断裂地连接于质量标记分子的配体和特殊的核酸。较佳的可断裂的连接物似乎是化学可断裂的或光可断裂的。这些申请公开了许多离子 化方法和使用四极质量分析仪、TOF分析仪和扇形磁场仪器进行的分析，将它们作为采用质谱法分析质量标记物的特殊方法。分析物材料所产生的质谱对污染物非常敏感。基本上，可电离的导入质谱仪中的任何材料都将出现在质谱中。这意味着对于许多分析，需要在将分析物导入质谱仪前进行小心地纯化。对于高通量系统，为了通过使用质量标记物对分析物进行间接分析的目的，需要避免任何不需的样品制备步骤。即，需要能检测污染材料背景中的标记物，并能确定所检测到的峰事实上与标记物相符。现有的技术没有公开在以检测系统为基础的质谱法中改进信噪比的方法或组合物，或者可提供证明谱中由质量标记物的存在引起的质量峰的方法或组合物。为了在液相层析或电泳分离后检测分析物，需要使所使用的标记物对分离过程产生的干扰最小。如果使用这类分析物的阵列，则需要阵列中的各个成员对与它们连相关的分析物的影响与其它标记物相同。这在某种程度上与质量标记的意图有抵触，这种意图产生基于其质量在质谱仪中可分解的标记物阵列。质量标记物较佳应可被分解成4道尔顿，以防止一种标记物的同位素峰受到其它标记物的同位素峰的干扰。这意味着为了产生250个不同的质量标记物，可能需要标记物的范围扩展到约1000道尔顿，可能还更多，因为重要的是产生被4道尔顿精确分离的大阵列的标记物。这个质量范围质量将几乎肯定会产生对采用质谱法进行检测的任何分离过程产生不同影响的质量标记物。这对仪器设计也有关系，因为随着质量范围的增加超过了质谱仪可检测离子的范围，仪器的成本也増加。
技术实现思路
因此，本专利技术的ー个目的是解决与上述现有技术相关的问题，并提供在污染背景中可检测到的质量标记物，以及作为质量标记物的身份可被证实的标记物。此外，本专利技术的ー个目的是提供在压缩的质量范围内可被分解的标记物的阵列，这样这些标记物不会对分离过程有太多干扰，以及提供在质荷比的有限范围内检测离子的质谱仪中可容易地被检测到的标记物的阵列。本专利技术还有ー个目的是提供分析生物分子的方法，该方法利用本专利技术的标记物使通量、信噪比和这些检测的敏感性最大化，具体是在遗传分析中，更具体是用在分析蛋白质的双向凝胶电泳中。此外，下面公开的质量标记物的设计使得为检测质量标记物的目的而设计出ー种简易的串联质谱仪。第一质量分析仪仅仅需要选择有限量的其质量相对低的离子。第二质量分析仪仅仅需要检测少量的断裂产物。因此，本专利技术提供一组两个或多个质量标记物，组中的各个标记物含有通过可断裂的连接物连接于质量归一化部分的质量指示部分，此部分具有抗碎裂性，其中，组中各标记物的聚集质量(aggregate mass)可相同或不同，并且,组中各标记物的质量指示部分的质量可相同或不同，其中，在组中具有共同质量的质量指示部分的任何类的标记物中，各标记物具有不同于该类中所有其它标记物的聚集质量，并且，在组中具有共同聚集质量的任何类的标记物中，各标记物具有其质量不同于该类中所有其它质量指示部分的质量的质量指示部分，这样，采用质谱法分析时组中所有的质量标记物都可互相区分。术语“质量指示部分”在本文中指采用质谱法检测到的部分，而术语“质量归ー化部分”在本文中指采用质谱法不一定能检测到的部分，但是它的存在确保了质量标记物具有所需的聚集质量。组中标记物的数量并没有特殊的限制，但条件是该组含有许多的标记物。但是，组中含有两种以上、三种以上、四种以上或五种以上的标记物较佳。 本专利技术还提供质量标记物的阵列，该阵列含有两组以上上述阵列标记物，其中，任ー组中各质量标记物的聚集质量与阵列中其它组中的每个质量标记物的聚集质量不同。本专利技术还提供ー种分析方法，该方法包括采用质谱法鉴别不同于分析物的质量标记物或其组合，从而检测分析物，其中，质量标记物是上述的标记物组或其阵列中的质量标记物。 附图说明现在，本专利技术将结合附图仅采用举例方式作更详细的描述，其中图I显示三重四极质谱仪的示意性布局图；图2显示形成本专利技术的标记物组的10个片段，包括5个质量归ー化部分(Mtl-M4)和5个质量指示部分(XcrX4)，其中，将氟原子取代基用作质量调节部分；图3显示本专利技术ー组5个标记物，由图2的质量归一化部分和质量指示部分形成；图4显示本专利技术ー组5个质量标记物,其中,所有的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组两种或多种质量标记物，组中各标记物包含通过连接物连接于质量归一化部分的质量指示部分，所述连接物含有在质谱仪中可断裂的基团，其中，各质量归一化部分确保质量标记物具有所需的聚集质量，且组中各质量指示部分的质量相同，其中，组中各标记物具有与该组中的所有其它标记物不同的质量，并且，组中所有的质量标记物可通过质谱法得以相互区分。

【技术特征摘要】
2000.03.14 GB 0006141.61.一组两种或多种质量标记物，组中各标记物包含通过连接物连接于质量归一化部分的质量指示部分，所述连接物含有在质谱仪中可断裂的基团，其中，各质量归一化部分确保质量标记物具有所需的聚集质量，且组中各质量指示部分的质量相同，其中，组中各标记物具有与该组中的所有其它标记物不同的质量，并且，组中所有的质量标记物可通过质谱法得以相互区分。2.如权利要求I所述的ー组质量标记物，其特征在于，所述组中的各质量标记物具有下述结构 M (A) y-L_X (A) z 式中，M是质量归ー化部分，X是质量指示部分，A是质量调节部分，L是可断裂的连接物，y和z是O或O以上的整数，y+z是I或I以上的整数。3.如权利要求2所述的ー组质量标记物，其特征在于，所述质量调节部分选自 (a)位于所述质量指示部分和/或质量归一化部分的基本结构内的同位素取代基； (b)连接于所述质量指示部分和/或质量归一化部分的基本结构的取代基原子或基团。4.如权利要求3所述的ー组质量标记物，其特征在干，所述质量调节部分选自卤原子取代基、甲基和2H或13C同位素取代基。5.如权利要求4所述的ー组质量标记物，其特征在干，所述质量调节部分是氟原子取代基。6.如前述权利要求中任一项所述的ー组质量标记物,其特征在于,将所述质量指示部分连接于所述质量归ー化部分的可断裂连接物是可通过碰撞而断裂的连接物。7.如权利要求6所述的ー组质量标记物，其特征在干，所述可断裂的连接物包含酰胺键。8.如前述权利要求中任一项所述的ー组质量标记物，其特征在干，所述质量归ー化部分包含抗断裂基团。9.如权利要求8所述的ー组质量标记物，其特征在于，所述质量归ー化部分包含苯基。10.如前述权利要求中任一项所述的ー组质量标记物,其特征在于,所述质量指示部分包含预电离的基团。11.如权利要求10所述的ー组质量标记物，其特征在于，所述质量指示部分包含N-甲基批淀基，或包含选自以下的基团_NH2、-NR2> -NR3+、-SR3+、-SO3、_P04、_P03、-CO2、12.如权利要求2-11中任一项所述的ー组质量标记物，其特征在于，所述组中各标记物具有下述结构13.如权利要求12所述的ー组质量标记物，其特征在于，所述R是H，L是酰胺键，p=0，A是氟原子。14.一组两种或多种探针，其特征在干，组中各探针不同，它们连接于独特的质量标记物或质量标记物的独特组合，所述质量标记物来自权利要求1-13中任一项所述的质量标记物组。15.如权利要求14所述的探针组，其特征在于，所述各探针连接于质量标记物的独特组合，每种组合由该质量标记物组中每种质量标记物的存在与否得以区别，和/或由连接于该探针的各质量标记物的数量加以区別。16.如权利要求14-15中任一项所述的探针组，其特征在于，所述各探针包含生物分子。17.如权利要求16所述的探针组，其特征在于，所述生物分子选自DNA、RNA、寡核苷酸、核酸碱基、蛋白质和/或氨基酸。18.ー种分析方法，该方法包括，采用质谱法鉴别质量标记物或质量标记物的組合，从而同时检测两种或多种分析物，其中，所述质量标记物是权利要求1-13中任ー项所定义的质量标记物组的质量标记物。19.如权利要求18所述的方法，其特征在干，由来自质量标记物组的质量标记物的独特组合鉴别每种分析物，各种组合由所述组中的每种标记物的存在与否而得以区别，和/或由各质量标记物的数量而加以区別。20.如权利要求18-19中任ー项所述的鉴别两种或多种分析物的方法，其特征在于，在采用质谱法检测质量标记物之前，先根据所述分析物的质量将它们分离。21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，采用色谱法或电泳进行分离。22.如权利要求18-21中任一项所述的方法，其特征在于，用于检测质量标记物的质谱仪包括一个或多个质量分析仪，这些质量分析仪能使具有特定质量或质量范围的离子通过，以进行检测，和/或能使离子分解。23.如权利要求22所述的方法，其特征在干，使用质量分析仪选择对ー种或多种已知的质量标记物特异的具有特定质量或质量范围的离子，使所选择的离子分解，然后检测分解产物，以鉴别指示所选择的质量标记物的离子模型。24.如权利要求22或23所述的方法，其特征在于，所述质谱仪包括三个四极质量分析仪。25.如权利要求23或24所述的方法，其特征在于，所述第一质量分析仪用于选择具有特定质量或质量范围的离子，第二质量分析仪用于分解所选择的离子，第三个质量分析仪用于检测所产生的离子。26.如权利要求18-25中任一项所述的方法,其特征在于,所述方法包括 (a)使ー种或多种分析物与一组探针接触，其中，所述探针是权利要求14-17中任ー项所定义的探针； (b)通过检测与分析物相关的探针鉴别分析物。27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，在采用质谱法检测所述质量标记物前，先将质量标记物从所述探针上解离下来。28.如权利要求26或27所述的方法，其特征在于，所述方法包括使ー种或多种核酸与ー组杂交探针接触。29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述一组杂交探针是具有256个以内的四聚体的组，组中各探针具有不同的核酸碱基的组合。30.如权利要求18所述的ニ维质谱分析法，其特征在于，该方法包括 (a)提供两种或多种分析物，各分析物用质量标记物或质量标记物的组合标记，其中，这些质量标记物来自权利要求1-13中任ー项所定义的质量标记物组； (b)使所述质量标记物与所述分析物解离； (c)检测质量标记物； (d)在质谱仪中分解质量标记物，以从质量归ー化部分释放出质量指示部分； (e)检测质量指示部分； (f)在所述质量标记物的质谱和所述质量指示部分的质谱的基础上鉴别分析物。31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，在所述(c)步骤中，选择具有选定的质量或质量范围的质量标记物用于检测，和/或在(e)步骤中，选择具有特定质量的质量指示部分用于检測。32.如权利要求18所述的分析方法，其特征在于，该方法包括 (a)在分析物的第一特性的基础上，对标记的分析物的混合物进行第一分离处理； (b)在分析物的第二特性的基础上，对所得的分离分析物进行第二分离处理； (C)通过检测分析物的标记物，从而检测该分析物； 其中，这些分析物用来自权利要求1-13中任ー项所定义的质量标记物组或阵列的质量标记物标记。33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，在(a)步骤和/或(b)步骤中，根据所述分析物的长度或质量将它们分离。34.如权利要求32或33所述的方法，其特征在于，在(a)步骤和/或(b)步骤中，根据所述分析物的等电点将它们分离。35.如权利要求32-34中任一项所述的方法，其特征在于，所述分析物包括蛋白质、多肽、肽、氨基酸或核酸，或者它们的片段。36.如权利要求32-35中任一项所述的双向凝胶电泳法。37.根据权利要求18所述的表征核酸的方法，其特征在于，该方法包括 (a)提供ー组核酸片段，各片段具有可断裂地连接于其上、用于鉴别该片段的特征的质量标记物，所述质量标记物来自权利要求1-13中任ー项所定义的质量标记物组的质量标记物；(b)在它们的长度的基础上分离这些片段； (C)解离各片段，使其释放出其质量标记物； (d)采用质谱法测定各质量标记物，以描述各片段的特征与片段长度的关系。3...

【专利技术属性】
技术研发人员：G·施密斯，A·H·托马斯，R·A·W·约翰斯通，
申请(专利权)人：电泳有限公司，
类型：发明
国别省市：