本发明专利技术公开了一种PR8重组流感病毒，该重组流感病毒含有H6亚型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6个内部基因(PB1，PB2，PA，NP，M，NS基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突变位点：NS基因编码的NS2蛋白上具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变，NP基因编码的NP蛋白上具有G132A点突变。本发明专利技术还公开了上述PR8重组流感病毒的制备方法和应用。本发明专利技术通过构建重组质粒、共转染细胞和SPF鸡胚扩增得到的PR8重组流感病毒，能高效表达HA蛋白和/或NA基因，可用于大规模制备流感疫苗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及到疫苗的生产领域，具体地，是涉及到一种高效表达HA蛋白的重组流感病毒及其制备方法和应用。
流感是由正粘病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的一种急性、高度接触性传染 病，高致病性禽流感被国际动物卫生组织确定为A类疫病。流感病毒根据基质蛋白(Matrixprotein,Μ)的不同可以分为A、B、C三型。根据流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase, NA)抗原性的差异,又可将流感病毒分为不同的亚型，A型流感病毒根据HA划分为16个亚型，根据NA划分为9个亚型。流感病毒具有高度传染性，可通过飞沫传播，因此它能在短期内突然发生，迅速蔓延，造成不同程度的流行，甚至世界大流行。1983-1984年，美国宾州的高致病性禽流感暴发，造成1700万家禽死亡，损失近6500万美元。2003年年底，亚洲多个国家和地区暴发了高致病性的禽流感。禽流感的暴发，使I亿多只家禽死亡或被扑杀，部分国家禽肉产量和销售量急剧下降，价格下跌，禽肉及其制品进出口暂时中止；此外，家禽养殖业、饲料行业和旅游业也都受到不利的影响。据粮农组织估计，由此遭受的损失至少为5亿美元。此外，许多亚型的禽流感病毒具有跨宿主传播至人的能力，因而，该病的暴发也同时危害着社会公共安全。二十世纪爆发了三次流感的大流行，分别是1918年西班牙流感(HlNl)、1957年亚洲流感(H2N2)和1968年香港流感(H3N2)，其中最大规模的流行为西班牙流感。该流感疫病造成全球2000万人的死亡，超过第一次世界大战死亡人数,列全球所有传染病死亡的第一位。流感病毒的基因组由单股，负义RNA片段组成.。A型流感病毒分为8个片段，编码11种功能蛋白，片段1、2、3分别编码三个聚合酶蛋白PB2、PB1和PA ;片段4编码血凝素HA ;片段5编码核衣壳蛋白NP ;片段6编码神经氨酸酶NA ;片段7编码基质蛋白Ml和离子通道M2 ;片段8编码非结构蛋白NSl和NS2。其中HA和NA是流感病毒最主要的两种表面糖蛋白，HA蛋白是流感病毒最重要的保护性抗原。目前，各国对动物和人流感的预防控制采取了不同的措施，但是疫苗接种仍然是预防流感的最佳选择，因此研制有效的流感疫苗对于控制流感流行具有极其重要的意义。全病毒灭活疫苗是目前应用最广泛的疫苗，该疫苗安全性好，不会出现毒力返强和变异的危险，能够经受同种亚型流感病毒的攻击。目前已上市的流感疫苗基本都是使用鸡胚培养制备，国内外使用鸡胚培养疫苗已经有50年历史。由于鸡胚生产流感疫苗需要消耗大量的鸡胚，鸡胚带有潜在污染可能，而且培养周期过长，不易于扩大产量，不利于应对大规模的流感爆发。为此，世界卫生组织、美国政府等都鼓励发展细胞培养技术替代目前的鸡胚培养技术来生产流感疫苗。为加快细胞培养流感疫苗技术的开发，美国政府决定投资11亿美元资助葛兰素史克、edlmmune、诺华、DynPort、Solvay和巴斯德6个主要的流感疫苗开发新技术。在2007年，全球最大的生物制药公司之一诺华宣布其人用流感疫苗Optaflu上市，成为唯一获批(欧盟批准)的人用细胞培养流感疫苗，是50年流感疫苗生产史最重大的创新之一 。无论采用鸡胚法和大规模细胞制备法获得病毒，重要的影响因素便是疫苗种毒本身是不是高产量的病毒株。A/Puerto Rico/8/34(PR8)是一株鸡胚适应病毒株，是目前在鸡胚上高产株之一，疫苗研制中常常将PR8的6个内部基因与流行毒株的HA和NA基因重组(6+2模式)，将重组病毒作为疫苗株来提高病毒滴度。为了进一步提高PR8的病毒滴度，满足在流感大暴发时，巨大的疫苗需求量，科研人员进行了大量的研究，通过优化病毒基因来提高病毒株产量。研究发现该流感病毒一些蛋白的某个氨基酸位点对该病毒的增殖能力具有重要的影响，如PB2上360位的酪氨酸(Tyr)和NSl上55位的谷氨酸(Glu)也起到一定作用。
技术实现思路
本专利技术的目的之一，在于提供一种PR8突变重组流感病毒，该重组流感病毒可高效表达HA蛋白，适用于大规模生产流感疫苗。实现上述目的技术方案如下一种PR8重组流感病毒，其含有Hl亚型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6个内部基因(PB1，PB2, PA，NP, M，NS基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突变位点NS基因编码的NS2蛋白上具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变，NP基因编码的NP蛋白上具有G132A点突变，所述Hl亚型流感病毒是除PR8病毒以外的Hl亚型流感病毒(编码具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变的NS2蛋白的NS基因，以及编码具有G132A点突变的NP蛋白的NP基因，其核酸序列分别如SEQID. NO 20-23所示的核酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID. NO :24-27所示)。一种PR8重组流感病毒，其含有H3亚型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6个内部基因( 81，？82，？么，册^，吧基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突变位点NS基因编码的NS2蛋白上具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变，NP基因编码的NP蛋白上具有G132A点突变(编码具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变的NS2蛋白的NS基因，以及编码具有G132A点突变的NP蛋白的NP基因，其核酸序列分别如SEQ ID. NO 20-23所示的核酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID. NO :24-27所示)。一种PR8重组流感病毒，其含有H4亚型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6个内部基因( 81，？82，？么，册^，吧基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突变位点NS基因编码的NS2蛋白上具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变，NP基因编码的NP蛋白上具有G132A点突变(编码具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变的NS2蛋白的NS基因，以及编码具有G132A点突变的NP蛋白的NP基因，其核酸序列分别如SEQ ID. NO 20-23所示的核酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID. NO :24-27所示)。一种PR8重组流感病毒，其含有H5亚型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6个内部基因( 81，？82，？么，册^，吧基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突变位点NS基因编码的NS2蛋白上具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变，NP基因编码的NP蛋白上具有G132A点突变(编码具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变的NS2蛋白的NS基因，以及编码具有G132A点突变的NP蛋白的NP基因，其核酸序列分别如SEQ ID. NO 20-23所示的核酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID. NO :24-27所示)。一种PR8重组流感病毒，其含有H6亚型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6个内部基因( 81，？82，？么，册^，吧基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突变位点N本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种PR8重组流感病毒，其特征在于，其含有H6亚型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6个内部基因(PB1，PB2，PA，NP，M，NS基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突变位点：NS基因编码的NS2蛋白上具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变，NP基因编码的NP蛋白上具有G132A点突变。
【技术特征摘要】
1.一种PR8重组流感病毒，其特征在于，其含有H6亚型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6个内部基因( 81，？82，？么，册^，吧基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突变位点NS基因编码的NS2蛋白上具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变，NP基因编码的NP蛋白上具有G132A点突变。2.一种制备权利要求I所述的PR8重组流感病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤 构建分别包含H6亚型流感病毒的HA和NA基因的重组质粒； 构建包含PR8病毒突变基因片段的重组质粒，该PR8病毒突变基因片段选自下述突变的NS或NP基因片段编码含有E67S、或E74S、或NS2E67/74S点突变的...
【专利技术属性】
技术研发人员：李泽君，滕巧泱，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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