本发明专利技术涉及化学修饰的重组促红细胞生成素及制备方法，采用基因工程技术对促红素进行重组，在促红素中引入了具有化学活泼酮基的2-氨-8-氧代壬酰残基，在聚乙二醇对重组促红素共价修饰时，聚乙二醇特异性地与2-氨-8-氧代壬酰残基反应，反应完全，且不与其他氨基酸残基发生反应，所需要的反应条件较温和，解决了现有技术中选择性差、反应条件恶劣的问题。聚乙二醇化的重组促红素的药代动力学研究结果、血细胞比容测定结果均优于天然的促红素。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，具体涉及化学修饰的。
技术介绍
促红细胞生成素(Erythropoietin)也称促红素,英文简称ΕΡ0,是一种糖蛋白激素，其主要的生理功能是刺激骨髓红细胞前体细胞的分化与增殖，因此EPO被认为是促进红细胞的产生并能够调节体内的红细胞总量在最适宜水平的主要调节因子。天然人促红细胞生成素(hEPO)是一种主要由肾脏合成并分泌的糖蛋白激素。当肾脏功能衰竭时，EPO就无法正常合成，因而导致红细胞生成数量的减少，即造成贫血。贫血是慢性肾病的常见症状之一，以前对于慢性肾病引起的贫血没有有效的预防和治疗措施， 基本上只能是通过输血来暂时缓解症状。随着现代基因技术的发展，1984年重组人促红素(r-HuEPO)首次研究成功并广泛应用于临床，大大加速了人们对促红素的基础及应用研究，并为肾性贫血病患者提供了新的医疗途径。现有的研究表明促红素的作用要比以前所认识到的广泛，它不仅适用于慢性肾功能衰竭导致的贫血、恶性肿瘤或化疗导致的贫血、失血后贫血和艾滋病引起的贫血等，还可以降低病人对输血的需求，减少艾滋病以及病毒性肝炎等通过血液制品传播疾病的发生几率。目前，越来越多得贫血患者在接受EPO治疗。目前医药市场上的促红素产品以第一代重组促红素为主，主要在中华豚鼠细胞内表达和然后纯化。而第一代重组促红素，因其血浆半衰期较短以及对蛋白酶降解的敏感性，其在体内的生物利用度较低。针对第一代产品的缺陷，目前已经开发出第二代重组促红素产品(以罗氏制药(Roche)开发出来的CERA为代表)，即经聚乙二醇(PEG)修饰的重组促红素。聚乙二醇(PEG)的非抗原性水溶性聚合物常被运用到治疗和诊断有重大意义的多肽的共价修饰上。例如PEG共价连接到白介素、干扰素等治疗性多肽上，已经报道PEG的共价修饰可以延长这些治疗性多肽在体内的半衰期、和/或降低它们的免疫原性和抗原性。同样的，PEG的共价修饰也适用于重组促红素。临床实验也证明了，将无体内活性或生物利用度较低的重组促红素经聚乙二醇共价修饰，可以获得具有体内促红细胞生产活性的重组促红素产品，该产品的半衰期是第一代重组促红素产品的16倍以上。除了 PEG以外，其他的聚环氧烷(非抗原性水溶性聚合物)也能用于修饰重组促红素，起到延长血浆半衰期的作用。到目前为止，已经公开了重组促红素的多种类型的聚乙二醇化学修饰方法，例如W094/28024公开了一种具有促红细胞生成素活性的糖修饰的PEG缀合物，其中PEG与rEPO的被氧化的糖链连接，在PEG化学修饰方法中，A)若只是采用纯化学的方法缀合到PEG上(例如罗氏制药的CERA是通过对重组促红素内的自由氨基进行PEG化学修饰)，这类方法通常都存在选择性差(无法定向和/或特异性修饰)，以及反应条件恶劣等缺陷；B)采用PEG对重组促红素的被氧化的糖基进行共价修饰，由于共价修饰前涉及到糖基化以及糖基氧化的步骤，这类方法同样存在选择性差、反应不完全的缺陷。WO 90/12874中公开了单甲氧基-PEG-EPO(mPEG-EPO)的制备方法，其中EPO内通过基因工程手段导入了一个半胱氨酸残基，再将特定的PEG试剂共价连接到该残基上。将非天然氨基酸用基因编入法引入蛋白质是实现在单氨基酸残基水平上选择性标记蛋白质的一种非常有效的方法，该方法利用一琥珀型抑制因子tRNA(tRNAraA)通读一个存在于mRNA读码框内的琥珀型终止密码子(UAG)，在此过程中，氨酰基-tRNA合成酶对该tRNA进行了非天然氨基酸酰化，该体系与发现于一些产(甲)烷古生菌和一种革兰氏阳性菌(Desulfitobacterium hafniense)细胞内天然进行的卩比咯赖氨酸(Pyl)引入机制相同，在这些生物细胞内，一个读码框内的琥珀密码子对Pyl进行共同翻译并插入蛋白质中，这一琥珀密码子被一类具有CUA反密码子并且由吡咯赖氨酰基氨酰基-tRNA合成酶(PylRS)进行Pyl酰化的Pyl琥珀型抑制因子tRNA (pylT)所抑制，这些生物体内的PylRS-pylT配对体与细胞内其他类型的合成酶-tRNA配对体正交，即无相互作用，因此该配对体只针对Pyl以 确保精确引入Pyl。与Pyl引入机制类似，特定的氨酰基-tRNA合成酶可以将非天然氨基酸特定连接到其同源tRNAo^上,形成正交的合成酶-tRNA·配对体，当这一合成酶-tRNAo^配对体在细胞中表达时，非天然氨基酸在琥珀密码子处被高效、精确地定点引入到蛋白质中。这一方法可在细菌、酵母、及哺乳动物细胞内将多种非天然氨基酸定点引入蛋白质，并用以研究大量生物学课题。
技术实现思路
本专利技术引入了两种非天然氨基酸，4-乙酰苯丙氨酸(AcF)和2-氨基-8-羰基壬酸(KetoK)，均包含功能性酮基，引入这两类非天然氨基酸可用于蛋白质定点修饰。本专利技术将这两类非天然氨基酸引入促红细胞生成素(EPO)基因，并成功用于促红细胞生成素与带有羟胺基的20K聚乙二醇(PEG)的共价连接。本专利技术提供了两种化学修饰的重组促红细胞生成素，在第一种重组促红细胞生成素中，第65位和/或第152位的氨基酸残基为4-乙酰苯丙氨酰残基，至少一个4-乙酰苯丙氨酰残基上共价连接了聚乙二醇；在第二种重组促红细胞生成素中，第65位和/或第152位的氨基酸残基为2-氨-8-氧代壬酰残基，至少一个2-氨-8-氧代壬酰残基上共价连接了聚乙二醇。本专利技术还提供了上述化学修饰的重组促红细胞生成素的制备方法，该方法采用基因工程技术对促红素进行重组，在促红细胞生成素的第65位和/或第152位上引入具有化学活泼酮基的氨基酸残基，该氨基酸残基为4-乙酰苯丙氨酰残基或2-氨-8-氧代壬酰残基，然后用聚乙二醇对氨基酸残基进行化学修饰，聚乙二醇特异性地与4-乙酰苯丙氨酰残基或2-氨-8-氧代壬酰残基反应，反应完全且不与其他氨基酸残基发生反应，所需要的反应条件较温和，解决了现有技术中选择性差、反应条件恶劣的问题。用来化学修饰4-乙酰苯丙氨酰残基或2-氨-8-氧代壬酰残基的聚乙二醇是一类亲水聚合物，优选地，羟氨基或联氨基取代的聚乙二醇，这类聚乙二醇可以更特异地与4-乙酰苯丙氨酰残基或2-氨-8-氧代壬酰残基上的化学活泼的酮基反应，反应更完全，所需的反应条件很温和，一般只需要在生理条件下反应即可。具有4-乙酰苯丙氨酰残基的重组促红细胞生成素的制备方法包括(I)构建含有编码4-乙酰苯丙氨酰-tRNA合成酶基因、琥珀突变抑制tRNA基因、在第65位和/或第152位发生琥珀无义突变的促红细胞生成素基因的重组表达载体，编码4-乙酰苯丙氨酰-tRNA合成酶基因序列如SEQ ID No. 2所述，琥珀突变抑制tRNA基因序列如SEQ ID No. I所述，在第65位发生琥珀无义突变的促红细胞生成素基因序列如SEQID No. 3所述，在第152位发生琥珀无义突变的促红细胞生成素基因序列如SEQ ID No. 4所述；(2)将所述重组表达载体转染宿主细胞，培养所述宿主细胞并从中分离得到在第65位和/或第152位具有4-乙酰苯丙氨酰残基的重组促红细胞生成素；(3)采用聚乙二醇对分离得到的所述重组促红细胞生成素上的至少一个4-乙酰苯丙氨酰残基进行化学修饰。 在一种具体实施方式中,所述重组表达载体为重组质粒pcDNA3. I-E本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种化学修饰的重组促红细胞生成素，其中，第65位的氨基酸残基为2？氨？8？氧代壬酰残基，所述的2？氨？8？氧代壬酰残基是通过在促红细胞生成素基因序列的第65位发生琥珀无义突变后由该琥珀无义突变的位置翻译而成的，在第65位发生琥珀无义突变的促红细胞生成素基因序列如SEQ？ID？No.3所述，所述的2？氨？8？氧代壬酰残基上共价连接了聚乙二醇。
【技术特征摘要】
1.一种化学修饰的重组促红细胞生成素，其中，第65位的氨基酸残基为2-氨-8-氧代壬酰残基，所述的2-氨-8-氧代壬酰残基是通过在促红细胞生成素基因序列的第65位发生琥珀无义突变后由该琥珀无义突变的位置翻译而成的，在第65位发生琥珀无义突变的促红细胞生成素基因序列如SEQ ID No. 3所述，所述的2-氨-8-氧代壬酰残基上共价连接了聚乙二醇。2.如权利要求I所述的重组促红细胞生成素，其中，所述的聚乙二醇为羟氨基或联氨基取代的聚乙二醇。3.制备如权利要求I所述的重组促红细胞生成素的方法，其中，该方法包括 (1)构建含有编码2-氨-8-氧代壬酰-tRNA合成酶基因、琥珀突变抑制tRNA基因、在第65位发生琥珀无义突变的促红细胞生成素基因的重组表达载体，所述编码2-氨-8-氧代壬酰-tRNA合成酶基因序列如SEQ ID No. 6所述，所述琥珀突变抑制tRNA基因序列如SEQ IDNo. 5所述，所述在第65位发生琥珀无...
【专利技术属性】
技术研发人员：万为，
申请(专利权)人：苏州元基生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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