生成哺乳动物样复合N-聚糖的酵母菌株制造技术

本文中描述了可用于生成含有哺乳动物样复合N-聚糖或含有哺乳动物糖基化途径中的中间体的靶分子的方法和经工程化改造的真菌细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于在真菌细胞中生成糖蛋白的方法和材料，且更具体而言，涉及生成含有哺乳动物样复合N-聚糖的蛋白质或含有哺乳动物糖基化途径内的中间体的蛋白质的遗传工程真菌细胞。专利技术背景 需要高效表达系统来生产目前开发下的大多数生物药物(例如，重组蛋白)。许多这些生物药物的生物学活性依赖于其翻译后修饰(例如，磷酸化或糖基化)。基于酵母的表达系统组合易于遗传操作与具有分泌并修饰蛋白质的能力的微生物生物体的发酵。然而，酵母细胞中生成的重组糖蛋白主要展现出异源高甘露糖和高甘露糖聚糖结构，其对于蛋白质功能、下游加工、及随后的治疗性用途，特别地在糖基化发挥生物学重要作用的情况中可以是不利的。专利技术概述可以使用本文中所描述的方法和遗传工程真菌细胞来生产靶分子(例如，靶蛋白)，其含有哺乳动物样N-聚糖或含有哺乳动物(例如人)糖基化途径内的中间体。自此类工程化改造细胞分离的靶分子可以用于生物药物应用，包括抗体生产、细胞因子生产，及用于治疗代谢病症诸如溶酶体贮积病。在一方面,本文件的特征在于一种生成能够生成包含GlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的蛋白质的真菌细胞(例如，解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolytica)或陆地酵母(Arxulaadeninivorans))的方法。该方法包括提供遗传工程化改造为生成包含Man5GlcNAc2 N-聚糖的蛋白质的真菌细胞；并将编码GlcNAc转移酶I的核酸导入细胞中,其中所述核酸包含编码将编码的GIcNAc转移酶I靶向至胞内区室(例如，高尔基体)的靶向序列的核苷酸序列，其中GlcNAc转移酶I在真菌细胞中的表达生成包含GlcNAcMan5GlcNAc2 N-聚糖的蛋白质。该方法可以进一步包括将编码靶蛋白的核酸导入细胞中，其中所述细胞生成修饰为包含GlcNAcMan5GlcNAc2 N-聚糖的革巴蛋白。革巴蛋白可以结合Fe受体。革巴蛋白可以是抗体或其片段。靶蛋白可以是治疗性糖蛋白。靶蛋白可以是干扰素-iKGM-CSF、干扰素Y、或促红细胞生成素。遗传工程化改造为生成含有Man5GlcNAc2 N-聚糖的蛋白质的真菌细胞可以是OCHl活性缺陷的，并且包括编码α-1，2_甘露糖苷酶的核酸，其中编码α-1，2_甘露糖苷酶的核酸包括编码将编码的α-1，2_甘露糖苷酶靶向至内质网的靶向序列的核苷酸序列。靶向序列可以是HDEL序列。所述方法可以进一步包括将编码甘露糖苷酶II的核酸导入细胞中，其中编码甘露糖苷酶II的核酸包括编码将编码的甘露糖苷酶II靶向至高尔基体的靶向序列的核苷酸序列，其中甘露糖苷酶II在真菌细胞中的表达生成含有GlcNAcMan3GlcNAc2 N-聚糖的蛋白质。所述方法可以进一步包括将编码半乳糖基转移酶的核酸导入细胞中，其中编码半乳糖基转移酶的核酸包含编码将编码的半乳糖基转移酶靶向至高尔基体的靶向序列的核苷酸序列，其中所述半乳糖基转移酶在真菌细胞中的表达生成含有GalGlcNAcMan5GlcNAc2或GalGlcNAcMan3GlcNAc2 N-聚糖的蛋白质。半乳糖基转移酶可以是UDP-Gl c-4-差向异构酶和β_1，4-半乳糖基转移酶I的催化域的融合物。此方法可以进一步包括将编码靶蛋白的核酸导入细胞中，其中所述细胞生成修饰为含有GalGlcNAcMan5GlcNAc2或GalGlcNAcMan3GlcNAc2 N-聚糖的靶蛋白。该方法可以包括分离修饰为含有GalGlcNAcMan5GlcNAc2 或 GalGlcNAcMan3GlcNAc2 N-聚糖的革巴蛋白。在另一方面，本文件的特征在于一种生成含有GlcNAcMan3GlcNAc2 N-聚糖的靶蛋白的方法。该方法包括提供遗传工程化改造为包含编码GIcNAc转移酶I、α-1，2_甘露糖苷酶、和甘露糖苷酶II的核酸的真菌细胞(例如，解脂耶氏酵母或陆地酵母)，其中所述核 酸编码靶向序列的核苷酸序列，或编码多种靶向序列的多种核苷酸序列，所述靶向序列将每种编码的蛋白质靶向至胞内区室，其中所述真菌细胞是OCHl活性缺陷的；并将编码靶蛋白的核酸导入细胞中，其中所述细胞生成含有GlcNAcMan3GlcNAc2 N-聚糖的靶蛋白。编码α -1，2-甘露糖苷酶的核酸可以包含将编码的α -1，2-甘露糖苷酶靶向至内质网的内质网靶向序列。例如，靶向序列可以是HDEL序列。编码GlcNAc转移酶I和甘露糖苷酶II的核酸可以包含闻尔基祀向序列、或多种闻尔基祀向序列，其将编码的GlcNAc转移酶I和甘露糖苷酶II靶向至高尔基体。靶蛋白可以结合Fe受体。靶蛋白可以是抗体或其片段。靶蛋白可以是治疗性糖蛋白。靶蛋白可以是干扰素-iKGM-CSF、干扰素Y、或促红细胞生成素。在一些实施方案中，所述方法可以进一步包括将编码半乳糖基转移酶的核酸导入细胞中，其中编码半乳糖基转移酶的核酸包含编码将编码的半乳糖基转移酶靶向至高尔基体的靶向序列的核苷酸序列，其中半乳糖基转移酶在真菌细胞中的表达生成修饰为含有GalGlcNAcMan3GlcNAc2 N-聚糖的靶蛋白。可以自真菌细胞分离修饰为含有GalGlcNAcMan3GlcNAc2 N-聚糖的革巴蛋白。本文件的特征还在于一种生成能够生成含有GlcNAcMan3GlcNAc2 N-聚糖的蛋白质的真菌细胞(例如，解脂耶氏酵母或陆地酵母)的方法。该方法包括提供遗传工程化改造为生成含有Man3GlcNAc2 N-聚糖的蛋白质的真菌细胞；并将编码GlcNAc转移酶I的核酸导入细胞中，其中所述核酸包含编码将编码的GlcNAc转移酶I靶向至胞内区室(例如，高尔基体)的靶向序列的核苷酸，其中GlcNAc转移酶I在真菌细胞中的表达生成含有GlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖的蛋白质。该方法可以进一步包括将编码革巴蛋白的核酸导入细胞中，其中所述细胞生成修饰为含有GlcNAcMan3GlcNAc2 N-聚糖的革巴蛋白。革巴蛋白可以结合Fe受体。靶蛋白可以是抗体或其片段。靶蛋白可以是治疗性糖蛋白。靶蛋白可以是干扰素-0、GM-CSF、干扰素Y、或促红细胞生成素。遗传工程化改造为生成含有Man3GlcNAc2 N-聚糖的蛋白质的真菌细胞可以是ALG3活性缺陷的，并且包含编码α -1,2-甘露糖苷酶的核酸，其中所述核酸包含编码将编码的α-1，2_甘露糖苷酶靶向至内质网的靶向序列的核苷酸序列。此类真菌细胞可以进一步是OCHl活性缺陷的和/或进一步包括编码α -1,3-葡萄糖基转移酶(例如，ALG6)的核酸。所述方法可以进一步包括将编码GIcNAc转移酶II的核酸导入细胞中，其中编码GlcNAc转移酶II的核酸包含编码将编码的GIcNAc转移酶II靶向至胞内区室的靶向序列的核苷酸序列，其中GIcNAc转移酶II在真菌细胞中的表达生成含有GlcNAc2Man3GIcNAc2N-聚糖的蛋白质。所述方法可以进一步包括将编码半乳糖基转移酶的核酸导入细胞中，其中编码半乳糖基转移酶的核酸包含编码将编码的半乳糖基转移酶靶向至高尔基体的靶向序列的核苷酸序列，其中半乳糖基转移酶在真菌细胞中的表达生成含有GalGlcNAcMan3GlcNAc2或Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-聚糖的蛋白质。半乳糖基转移酶可以本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.11.19 US 61/262,8281.一种生成能够生成包含GlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的蛋白质的真菌细胞的方法，所述方法包括 a)提供遗传工程化改造为生成包含Man5GlcNAc2N-聚糖的蛋白质的真菌细胞； b)将编码GIcNAc转移酶I的核酸导入所述细胞中，其中所述核酸包含编码将所述编码的GIcNAc转移酶I靶向至胞内区室的靶向序列的核苷酸序列，其中所述GIcNAc转移酶I在所述真菌细胞中的表达生成包含GlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的蛋白质。2.权利要求I的方法，所述方法进一步包括将编码靶蛋白的核酸导入所述细胞中，其中所述细胞生成修饰为包含所述GlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的所述祀蛋白。3.权利要求2的方法，其中所述靶蛋白结合Fe受体。4.权利要求3的方法，其中所述靶蛋白是抗体或其片段。5.权利要求2的方法，其中所述靶蛋白是治疗性糖蛋白。6.权利要求2的方法，其中所述靶蛋白是干扰素-i3、GM-CSF、干扰素Y、或促红细胞生成素。7.权利要求I的方法，其中所述胞内区室是高尔基体。8.权利要求I的方法，其中遗传工程化改造为生成含有Man5GlcNAc2N-聚糖的蛋白质的所述真菌细胞是OCHl活性缺陷的，并且包括编码α-1，2-甘露糖苷酶的核酸，其中编码所述α -I, 2-甘露糖苷酶的所述核酸包括编码将所述编码的α -I, 2_甘露糖苷酶靶向至内质网的靶向序列的核苷酸序列。9.权利要求8的方法，其中所述靶向序列是HDEL序列。10.权利要求I的方法，其中所述真菌细胞是解脂耶氏酵母或陆地酵母。11.权利要求I的方法，所述方法进一步包括将编码甘露糖苷酶II的核酸导入所述细胞中，其中编码所述甘露糖苷酶II的所述核酸包含编码将所述编码的甘露糖苷酶II靶向至高尔基体的靶向序列的核苷酸序列，其中所述甘露糖苷酶II在所述真菌细胞中的表达生成包含GlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖的蛋白质。12.权利要求I或权利要求11的方法，所述方法进一步包括将编码半乳糖基转移酶的核酸导入所述细胞中，其中编码所述半乳糖基转移酶的所述核酸包含编码将所述编码的半乳糖基转移酶靶向至高尔基体的靶向序列的核苷酸序列，其中所述半乳糖基转移酶在所述真菌细胞中的表达生成包含GalGlcNAcMan5GlcNAc2或GalGlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖的蛋白质。13.权利要求12的方法，所述方法进一步包括将编码靶蛋白的核酸导入所述细胞中，其中所述细胞生成修饰为包含所述GalGlcNAcMan5GlcNAc2 *GalGlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖的所述靶蛋白。14.权利要求12的方法，其中所述半乳糖基转移酶是UDP-Glc-4-差向异构酶和β -I, 4-半乳糖基转移酶I的催化域的融合物。15.权利要求13的方法，进一步包括分离修饰为包含所述GalGlcNAcMan5GlcNAc2或GalGlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖的所述靶蛋白。16.一种生成包含GlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖的靶蛋白的方法，所述方法包括 a)提供遗传工程化改造为包含编码GIcNAc转移酶I、α-I, 2_甘露糖苷酶、和甘露糖苷酶II的核酸的真菌细胞，其中所述核酸包含编码将每种编码的蛋白质靶向至胞内区室的靶向序列的核苷酸序列，其中所述真菌细胞是OCHl活性缺陷的；并 b)将编码靶蛋白的核酸导入所述细胞中，其中所述细胞生成包含所述GlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖的所述靶蛋白。17.权利要求16的方法，其中所述真菌细胞是解脂耶氏酵母或陆地酵母。18.权利要求16的方法，其中编码所述α-1，2-甘露糖苷酶的所述核酸包含将所述编码的α -I, 2-甘露糖苷酶靶向至内质网的内质网靶向序列。19.权利要求18的方法，其中所述靶向序列是HDEL序列。20.权利要求16的方法，其中编码所述GIcNAc转移酶I和所述甘露糖苷酶II的所述核酸包含编码将所述编码的GIcNAc转移酶I和甘露糖苷酶II靶向至高尔基体的高尔基靶向序列的核苷酸序列。21.权利要求16的方法，其中所述靶蛋白结合Fe受体。22.权利要求16的方法，其中所述靶蛋白是抗体或其片段。23.权利要求16的方法，其中所述靶蛋白是治疗性糖蛋白。24.权利要求16的方法，其中所述靶蛋白是干扰素-β、GM-CSF、干扰素、、或促红细胞生成素。25.权利要求16的方法，进一步包括将编码半乳糖基转移酶的核酸导入所述细胞中，其中编码所述半乳糖基转移酶的所述核酸包含编码将所述编码的半乳糖基转移酶靶向至高尔基体的靶向序列的核苷酸序列，其中所述半乳糖基转移酶在所述真菌细胞中的表达生成修饰为包含GalGlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖的所述靶蛋白。26.权利要求25的方法，进一步包括分离修饰为包含所述GalGlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖的所述靶蛋白。27.一种制备能够生成包含GlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖的蛋白质的真菌细胞的方法，所述方法包括 a)提供遗传工程化改造为生成包含Man3GlcNAc2N-聚糖的蛋白质的真菌细胞； b)将编码GIcNAc转移酶I的核酸导入所述细胞中，其中所述核酸包含编码将所述编码的GIcNAc转移酶I靶向至胞内区室的靶向序列的核苷酸序列，其中所述GIcNAc转移酶I在所述真菌细胞中的表达生成包含GlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖的蛋白质。28.权利要求27的方法，所述方法进一步包括将编码靶蛋白的核酸导入所述细胞中，其中所述细胞生成修饰为包含所述GlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖的所述祀蛋白。29.权利要求27的方法，其中所述靶蛋白结合Fe受体。30.权利要求27的方法，其中所述靶蛋白是抗体或其片段。31.权利要求27的方法，其中所述靶蛋白是治疗性糖蛋白。32.权利要求27的方法，其中所述靶蛋白是干扰素-i3、GM-CSF、干扰素Y、或促红细胞生成素。33.权利要求27的方法，其中所述胞内区室是高尔基体。34.权利要求27的方法，其中遗传工程化改造为生成包含Man3GlcNAc2N-聚糖的蛋白质的所述真菌细胞是ALG3活性缺陷的，并且包含编码α -I, 2_甘露糖苷酶的核酸，所述核酸包含编码将所述编码的α -I, 2-甘露糖苷酶靶向至内质网的靶向序列的核苷酸序列。35.权利要求34的方法，其中遗传工程化改造为生成包含Man3GlcNAc2N-聚糖的蛋白质的所述真菌细胞进一步是OCHl活性缺陷的。36.权利要求34或35的方法，其中遗传工程化改造为生成包含Man3GlcNAc2N-聚糖的蛋白质的所述真菌细胞进一步包含编码α -I, 3-葡萄糖基转移酶的核酸。37.权利要求36的方法，其中所述α-1，3-葡萄糖基转移酶是ALG6。38.权利要求27的方法，其中所述真菌细胞是解脂耶氏酵母或陆地酵母。39.权利要求27的方法，所述方法进一步包括将编码GIcNAc转移酶II的核酸导入所述细胞中，其中编码所述GIcNAc转移酶II的所述核酸包含编码将所述编码的GIcNAc转移酶II靶向至胞内区室的靶向序列的核苷酸序列，其中所述GIcNAc转移酶II在真菌细胞中的表达生成包含GlCNAC2Man3GlCNAC2N-聚糖的蛋白质。40.权利要求27或权利要求39的方法，所述方法进一步包括将编码半乳糖基转移酶的核酸导入所述细胞中，其中编码所述半乳糖基转移酶的所述核酸包含编码所述将所述编码的半乳糖基转移酶靶向至高尔基体的靶向序列的核苷酸序列，其中所述半乳糖基转移酶在所述真菌细胞中的表达生成包含GalGlcNAcMan3GlcNAc2或Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖的蛋白质。41.权利要求40的方法，所述方法进一步包括将编码靶蛋白的核酸导入所述细胞中，其中所述细...

【专利技术属性】
技术研发人员：SCJ盖森斯，W弗维肯，
申请(专利权)人：奥克西雷恩英国有限公司，
类型：
国别省市：