高灵敏度的免疫色谱方法以及免疫色谱用试剂盒技术

本发明专利技术提供一种免疫色谱方法，该免疫色谱方法通过在将信号放大时抑制假阳性的产生而能进行高灵敏度且假阳性得以降低的检测。该免疫色谱方法包含：在形成了被检物质与用针对被检物质的第一结合物质修饰过的含有金属的标记物质的复合体的状态下，将所述复合体在蛋白质的蛋白酶分解物的存在下在不溶性载体上展开；在含有针对被检物质的第二结合物质或对针对被检物质的第一结合物质具有结合性的物质的不溶性载体上的检测部位上捕捉被检物质和该标记物质；将捕捉到的标记物质放大来检测被检物质。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及使用了标记抗体的免疫色谱方法以及免疫色谱用试剂盒。
技术介绍
作为测定被检液中的特定成分的方法，存在许多利用了抗原抗体反应的免疫测定方法。在免疫测定方法中，抗体或抗原与待测定的特定成分的非特异性反应常常是个问题。因此，通常采用使用封闭剂来抑制非特异性反应的方法。作为使用了封闭剂的非特异反应抑制法，例如在ELISA的情况下将反应容器使用封闭剂进行处理，在胶乳凝聚法的情况下将胶乳粒子使用封闭剂进行处理(专利文献I)。作为封闭剂，使用牛血清白蛋白(以下简称为BSA)、酪蛋白、明胶等。另外，在专利文献2中记载了如下内容通过使用在EIA体系中在pH为7. 2的条 件下在100°C下进行了 30分钟热处理而得到的酪蛋白，能制作抑制非特异反应的载体。此夕卜，在专利文献3中公开了如下内容通过在要进行免疫测定的反应液中添加用蛋白酶分解至分子量约为1000 26000而得到的酪蛋白来抑制非特异反应。在免疫测定方法中，免疫色谱法由于操作简便、能在短时间内进行测定，因此很常用。作为免疫色谱法中使用的免疫反应，广泛使用竞争型反应或三明治型反应。其中，在免疫色谱法中三明治型反应是主流，在其典型例子中，为了检测试样中的由抗原构成的被检物质而进行如下操作。首先，通过将利用针对作为被检物质的抗原的抗体而致敏得到的微粒作为固相微粒固定于色谱载体，或者通过将该抗体本身直接固定于色谱载体，从而制备具有反应部位的色谱载体。另一方面，使标记微粒被能与被检物质特异性结合的抗体致敏来制备致敏标记微粒。使该致敏标记微粒与试样一起在色谱载体上进行色谱移动。通过以上的操作，在形成于色谱载体的反应部位上，被固定的抗体成为固定试剂，致敏标记微粒通过作为被检物质的抗原而与其特异性结合，其结果是，通过目视判断因致敏标记微粒被反应部位捕捉而产生的信号的有无或程度，即可测定试样中的被检物质的存在的有无或量。另外，在免疫色谱法中，为了抑制非特异吸附，通常在检体稀释液中添加蛋白质等封闭剂(专利文献4)。现有技术文献专利文献专利文献I :日本特开平6-313766号公报专利文献2 日本特开平6-194366号公报专利文献3 日本特开平2-36353号公报专利文献4 :日本特表2004-503248号公报
技术实现思路
专利技术要解决的技术问题在免疫色谱法中，为了避免因灵敏度低而检测不出作为被检物质的抗原(假阴性)的问题，有时采用使检测信号放大的方法。作为信号放大的方法，有时使用碱性磷酸酶、过氧化酶等酶作为标记，还有时通过对选自金属胶体标记以及金属硫化物标记中的标记使用含银化合物以及银离子用还原剂进行敏化(银放大)来进行检测。但是当使用了这些放大法时，有时会产生下述问题如果非特异性吸附于检测部位的标记被敏化，则虽然不存在作为被检物质的抗原但却检测出信号(假阳性)。特别是在进行信号放大的免疫色谱法中，即使是以往不会成为问题那样少的量的非特异吸附也会引发假阳性的问题。另外，在免疫色谱法中，为了抑制非特异吸附，通常在检体稀释液中添加蛋白质等封闭剂(专利文献4)，但并没有对于这种少量的非特异吸附有效的物质。另外，特别是在使用了银放大的免疫色谱法中，在使用了金属胶体标记物质和金属硫化物标记物质的免疫色谱用检测条上滴加检体并使其展开后，需要(I)使还原剂溶液展开、(2)滴加含银溶液(银放大液)。考虑到银离子的稳定性以及放大活性，银放大液通常以酸性为宜。但是，蛋白质多数会在酸性条件下析出，因此如果在银放大液中添加蛋白质，则蛋白质会析出。因此，当在检体稀释液中添加了蛋白质时，在酸性条件下蛋白质会在膜中凝聚而处处妨碍液体的流动，因此在放大后会形成斑。放大斑有时无法与检测部位的 显色区别开来，因此还会形成假阳性，是个严重的问题。本专利技术要解决的技术问题在于提供一种免疫色谱方法，该免疫色谱方法通过在免疫色谱方法中将信号放大时抑制假阳性的产生而能进行高灵敏度且假阳性得以降低的检测。用于解决技术问题的手段本专利技术人为了解决上述技术问题而进行了潜心研究，结果发现通过在酪蛋白等蛋白质的蛋白酶分解物的存在下进行免疫反应，能抑制标记的非特异吸附，从而抑制放大后的假阳性。根据本专利技术，可提供一种免疫色谱方法，其包含在形成了被检物质与用针对被检物质的第一结合物质修饰过的含有金属的标记物质的复合体的状态下，将所述复合体在蛋白质的蛋白酶分解物的存在下在不溶性载体上展开；在不溶性载体上的检测部位捕捉被检物质和标记物质，所述不溶性载体含有针对所述被检物质的第二结合物质或对针对被检物质的第一结合物质具有结合性的物质；将捕捉到的标记物质放大来检测该被检物质。优选蛋白质的蛋白酶分解物的分子量的范围为O. IkD 15kD。优选蛋白质的蛋白酶分解物是在酸性条件下不存在作为不溶成分的析出物的分解物。 优选蛋白质的蛋白酶分解物是通过在蛋白质的蛋白酶分解物中添加酸以使pH为4以下、并除去所析出的析出物而得到的蛋白质分解物。优选蛋白质的蛋白酶分解物是酪蛋白的蛋白酶分解物。优选作为蛋白质使用的酪蛋白是选自aSl酪蛋白、aS2酪蛋白、β酪蛋白、或K酪蛋白中的I种以上的酪蛋白。优选酪蛋白的蛋白酶分解物中含有来自aSl酪蛋白的肽序列(YLGYLEQLLR、FFVAPFPEVFGK、HQGLPQEVLNNLLR)、来自a S2酪蛋白的肽序列(FALPQYLK)、来自β酪蛋白的肽序列(AVPYPQR、YPVEPFTER)、来自κ酪蛋白的肽序列(YIPIQYVLSR)中的至少I种以上。优选不溶性载体是多孔性载体。优选含有金属的标记物质是金属胶体。优选金属胶体是金胶体。优选第一结合物质和第二结合物质中的至少任一方为抗体。优选使用包含含银化合物以及银离子用还原剂的放大液来进行将捕捉到的标记物质放大的工序。优选在形成了被检物质与用针对被检物质的第一结合物质修饰过的含有金属的标记物质的复合体的状态下，将所述复合体在蛋白质的蛋白酶分解物的存在下在不溶性载体上展开后，将洗涤液在不溶性载体上展开，然后将捕捉到的标记物质放大。优选对在检测时具有平均粒子大小为I μ m以上且20 μ m以下的大小的标记物质进行检测。或者，根据本专利技术，可提供一种免疫色谱用试剂盒，其具备用针对被检物质的第 一结合物质修饰过的含有金属的标记物质；以及含有针对被检物质的第二结合物质或对针对被检物质的第一结合物质具有结合性的物质的不溶性载体。优选第一结合物质和第二结合物质中的至少任一方为抗体。专利技术的效果根据本专利技术，能在免疫色谱方法的银放大中抑制放大后的假阳性，能进行明确且高灵敏度的测定。附图说明图I是示意地表示第I不溶性载体(免疫色谱用检测条)的一个方式的俯视图。图2是表示图I中所示的第I不溶性载体(免疫色谱用检测条)的一个方式的纵截面的示意图。在图I和图2中，I表示背面粘着片，2表示标记物质保持垫，3表示色谱载体(抗体固定膜)，3a表示捕捉部位，31表示检测部位，32表示对照部位，4表示吸收垫，5表示试样添加垫，10表示免疫色谱用检测条。含有被检物质的被检试样在色谱载体上展开的方向用箭头A表示。在本专利技术中，将箭头A的根部方向定义为上游，将箭头A的前端方向定义为下游。图3示意地表示能在本专利技术中使用的免疫色谱试剂盒的一个方式。51表示图I和图2中所示的第I不溶性载体(免疫色谱用检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种免疫色谱方法，其包含：在形成了被检物质与用针对被检物质的第一结合物质修饰过的含有金属的标记物质的复合体的状态下，将该复合体在蛋白质的蛋白酶分解物的存在下在不溶性载体上展开；在不溶性载体上的检测部位上捕捉被检物质和标记物质，所述不溶性载体含有针对被检物质的第二结合物质或对针对被检物质的第一结合物质具有结合性的物质；将捕捉到的标记物质放大来检测被检物质。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：片田顺一，知久浩之，
申请(专利权)人：富士胶片株式会社，
类型：发明
国别省市：