一种类志贺邻单胞菌的快速诊断方法技术

本发明专利技术提供了一种检测类志贺邻单胞菌的方法，所述方法利用环介导等温扩增技术，以hugA基因为目标基因，通过设计3对DNA引物，与待检测的DNA模板放入包括MgSO4和甜菜碱在内的扩增缓冲液中，在65℃恒温环境中扩增，再以80℃恒温环境终止反应，并对扩增产物进行检测。该方法设备简单，易操作、具有良好的特异性、灵敏度和重复性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，属于微生物快速诊断领域。
技术介绍
类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)是一种革兰氏阴性、能运动、兼性厌氧、氧化酶阳性的非孢子繁殖的细菌，曾与对人类致病的弧菌属和气单胞菌属一起归属于弧菌科，后研究发现其在分子水平跟类志贺邻单胞菌和变形杆菌属更为接近，在第二版《系统细菌学伯杰氏手册》中，类志贺邻单胞菌划归到肠杆菌科，邻单胞菌属。淡水水源和江河水生态环境是类志贺邻单胞菌的主要储存地，鱼类是类志贺邻单胞菌常见的宿主。最近几年由该菌引起的婴幼儿、老年人以及免疫功能不全病人的胃肠道感染病例逐渐增加，是人类肠胃炎的主要病因之一，世界各地屡有报道。类志贺邻单胞菌亦 可引起人类菌血症、蜂窝组织炎、脑膜炎等肠外感染，该菌亦与旅行者腹泻密切相关。来自日本的一项研究发现在1994至1996年间所有引起旅行者腹泻的肠杆菌中，类志贺邻单胞菌位居第一(66.7%)。由类志贺邻单胞菌引起的死亡率也在逐渐增高。一些类志贺邻单胞菌的感染者由于未能快速准确的诊断和合理的应用抗生素，而没有得到及时的治疗而产生了严重的后果，甚至死亡。虽然类志贺邻单胞菌诱发肠胃炎的致病机理并未完全阐明，但研究者已经对一些潜在的毒力因子进行了深入的研究。摄取铁离子与一些病原菌的毒力密切相关，人体中的亚铁血红素是病原菌铁离子的一个重要来源，并且许多病原菌本身就具有亚铁血红素运输系统，hugA基因是编码类志贺邻单胞菌亚铁血红素铁离子利用系统的重要基因之一，并且编码外膜蛋白受体，是影响类志贺邻单胞菌毒力的一个重要基因，因此也是一个理想的检测目的基因。目前类志贺邻单胞菌的检测方法主要有分离培养、生化鉴定，普通PCR和实时荧光PCR等分子生物学方法。分离培养方法操作步骤繁琐，检测周期长，一般需要3-5天完成，不能满足快速检测的需求。并且该菌缺少特异的筛选培养基，在一些肠道培养基上形成的菌落性状与嗜水气单胞相似，难以区别，这也影响了类志贺邻单胞菌的分离率。最近几年，PCR和实时荧光PCR分子生物学检测方法在病原菌检测中的应用越来越广，但这些方法的检测成本高，需要精密昂贵的热循环仪器，且对实验环境和操作者的技术也有严格的要求，因此限制了该技术的普遍适用性，不利于在农村地区以及基层实验室的推广应用。类志贺邻单胞菌做为一种新发的传染性疾病对流行病学家和临床医生造成的最大困难就是缺少能够对其进行早期、快速、准确检测的方法，以满足农村地区和基层实验室的实际工作需求。环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)是Notomi等建立的一种新的核酸扩增方法。LAMP是针对祀序列的6个特异部位设计4条引物，利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶在恒温条件下催化新链合成，从而使靶序列高效扩增。4 条引物之中 2 条为内引物，即 FIP(ForWard inner primer, FIP)和 BIP(Backwardinner primer, BIP)。FTP 包含 Flc 和 F2 (F2c 区域的互补序列)，即 5' _Flc_F2 ;BIP 包含Blc(Bl区域的互补序列)和B2，即5' -Blc-B2。外引物为F3和B3。LAMP反应过程包括哑铃状模板合成阶段、循环扩增阶段。LAMP反应中60 65°C是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65°C左右处于动态平衡状态，任何一个弓I物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。在链置换型DNA聚合酶的作用下，以FIP引物F2区段的3'末端为起点，与模板DNA互补序列配对，启动链置换DNA合成。F3引物与F2c前端F3c序列互补，以3'末端为起点，通过链置换活性DNA聚合酶的作用，一边置换先头FIP引物合成的DNA链。一边合成自身DNA，如此向前延伸。最终F3引物合成而得的DNA链与模板DNA形成双链。由FIP引物先合成的DNA链被F3引物进行链置换产生一单链，这条单链在5，末端存在互补的Flc和Fl区段，于是发生自我碱基配对，形成茎环结构。同时，BIP引物同该单链杂交结合，以BIP引物的3'端为起点，合成互补链，在此过程中茎环结构被打开。接着，类似于F3，B3引物从BIP引物外侧插入，进行碱基配对，以3'端为起点，在聚合酶的作用下，合成新的互补链。通过上述2个过程，形成双链DNA。被置换的单链DNA两端存在互补序列，自然发生自我碱基配对，形成环状结构，于是整条链呈现哑铃状结构，该结构是LAMP法基因扩增循环的起始结构。LAMP法基因扩增循环阶段首先在哑铃状结构中，以3'末端的Fl区段为起点，以自身为模板，进行DNA合成延伸。与此同时，FIP引物F2与环上单链F2c杂交，启动新一轮链置换反应，解离由Fl区段合成的双链核酸。同样，在解离出的单链核酸上也会形成茎环结构。在茎环结构上存在单链形式B2c，BIP引物上的B2与其杂交，启动新一轮扩增，经过相同的过程，又形成茎环结构。通过此过程，结果在同一条链上互补序列周而复始形成大小不一的结构。为了进一步缩短LAMP的反应时间，还可以在Flc-F2c/BIc_B2c之间设计一对环弓I物LF/LB，环引物通过结合在茎环结构的环状区域互补序列上，大大加速了整个链置换反应过程，从而提高了反应效率。LAMP可以特异、高效、快速的扩增DNA^ I小时之内使产物的量达到IO9个拷贝。LAMP方法最大的缺点就是容易出现假阳性，由于LAMP采用了多条引物，而且是在同一温度条件下进行扩增，引物之间有可能互补而扩增出非特异性条带，造成假阳性。因此LAMP方法对引物的特异性要求很高，设计也更为复杂。由于LAMP省略了 94°C变性步骤，同时退火和延伸步骤在同一温度(等温)条件下进行，反应体系的组成也较传统PCR复杂，除了反应体系中必须的缓冲液、dNTP引物、酶等成分外，还需要加入甜菜碱(betaine)、硫酸镁等必需成分,反应体系较为复杂,对体系中主要成分的配比优化液要求较高,否则会降低反应的特异性和灵敏性。本专利技术的目的就是通过引物设计和组分优化，建立一种类志贺邻单胞菌的方便、快速、特异、灵敏的LAMP检测方法，以能够在基层实验室进行大规模的推广使用。
技术实现思路
本专利技术提供了一种检测类志贺邻单胞菌的方法，所述方法包括如下步骤(I)将待检测样本、序列如SEQ ID NO 1_2所示的一对外引物、序列如SEQ ID NO3-4所示的一对内引物、序列如SEQ ID NO 5_6所示的一对环引物、dNTP、Bst DNA聚合酶、 MgSO4、甜菜碱以及环介导等温扩增缓冲液加入到反应容器中；(2)将步骤⑴所得的混合液放置于65°C恒温环境中进行DNA扩增反应；(3))将步骤⑵获得的产物放置于80°C恒温环境中，以终止步骤(2)所述的DNA扩增反应；(4)检测步骤⑶获得的产物。其中，SEQID NO I 为引物 F3，SEQ ID NO 2 为引物 B3，SEQ ID N03 为引物 FIP，SEQ ID NO 4 为引物 BIP，SEQ ID NO 5 为引物 LF，SEQ IDNO 6 为引物 LB。本方法检测的目的基因为类志贺邻单胞菌的hugA基因，引物设计所依据的基因序列为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测类志贺邻单胞菌的方法，所述方法包括如下步骤：(1)将待检测样本、序列如SEQ？ID？NO？1？2所示的一对外引物、序列如SEQ？ID？NO？3？4所示的一对内引物、序列如SEQ？ID？NO？5？6所示的一对环引物、dNTP、Bst？DNA聚合酶、MgSO4、甜菜碱以及环介导等温扩增缓冲液加入到反应容器中；(2)将步骤(1)所得的混合液放置于65℃恒温环境中进行DNA扩增反应；(3))将步骤(2)获得的产物放置于80℃恒温环境中，以终止步骤(2)所述的DNA扩增反应；(4)检测步骤(3)获得的产物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孟双，徐建国，叶长芸，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，
类型：发明
国别省市：