含有etr1基因的双元表达载体的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种含有etr1基因的双元表达系统的构建方法及其应用，扩增拟南芥突变体etr1基因并克隆至表达载体pEASY-T1上获得pEASY-T1-etr1质粒，在该质粒的AscI和BamHI限制性内切酶位点用双酶切体系酶切后获得etr1基因片段，用同样的双酶切体系对pFGC5941质粒进行双酶切获得骨架片段，将etr1基因片段和骨架片段用T4DNA连接酶进行连接，成为环状质粒，得到pFGC5941-etr1双元表达系统，将该系统应用于鲜切花，可将鲜切花寿命延长5～10天。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程
，特别是涉及一种含有etrl基因的双元表达载体的构建方法及其应用。
技术介绍
乙烯是高等植物中促进器官衰老和果实成熟的激素。ACC合成酶、ACC氧化酶是植物乙烯合成途径中的关键酶，ETR是信号传导途径的关键酶。根据同源依赖性基因沉默(HDGS)原理，导入正义基因和反义基因均可实现内源基因沉默。使用反义RNA技术，有效抑制乙烯生物合成和阻断其信号传导，从而延长切花植物的瓶插寿命。目前国外已从番茄、苹果、豌豆、桃、矮牵牛、香石竹、猕猴桃等植物中克隆到ACC氧化酶基因；澳大利亚的研究者将香石竹ACC氧化酶基因cDNA导入香石竹后，使香石竹花瓣衰老明显延迟；Satoh等 在菊花中转入mDG-ERSl (etrl - 4)基因(这是从菊花中克隆的编码乙烯受体蛋白的突变体)也成功获得了叶片黄化现象明显减少的植株。在国内，也有不少关于观赏植物中乙烯与花朵开放、衰老关系的报道，而鲜切花可方便的装饰各种环境，但鲜切花的瓶插寿命极短，一般只有几天，如果要保持较好的观赏效果，就要频繁的更换，这造成了极大的浪费。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种含有etrl基因的双元表达载体的构建方法及其在延长鲜切花瓶插寿命中的应用，将含有etrl基因的双元表达载体导入鲜切花，转基因的切花获得对乙烯不敏感的性状，可有效控制切花的衰老，延长其瓶插寿命。为了解决上述技术问题，本专利技术采用如下的技术方案含有etrl基因的双元表达载体的构建方法扩增拟南芥突变体etrl基因并克隆至表达载体pEASY-Tl上获得pEASY-Tl-etrl质粒，在该质粒的AscI和BamHI限制性内切酶位点用双酶切体系酶切后获得etrl基因片段，用同样的双酶切体系对PFGC5941质粒进行双酶切获得骨架片段，将etrl基因片段和骨架片段用T4 DNA连接酶进行连接，成为环状质粒，得到pFGC5941-etrl双元表达载体。上述构建方法中，扩增拟南芥突变体etrl基因的正向引物为5’ - ttGGCGCGCCaaCTCCCCTTTTCTCCTTCTC-3’，其中GGCGCGCC是添加的酶切位点，tt、aa是添加的保护碱基，CTCCCCTTTTCTCCTTCTC是特异引物序列；扩增拟南芥etrl基因的反向引物为5’ - cgGGATCCcgCCTTTACATGCCCTCGTACA-3’，其中GGATCC是添加的酶切位点，cg、cg是添加的保护碱基，CCTTTACATGCCCTCGTACA 是特异弓 I 物序列。前述含有etrl基因的双元表达载体的构建方法所述的拟南芥突变体etrl基因来自于编号为CS237的拟南芥突变体。本专利技术还提供了前述含有etrl基因的pFGC5941_etrl双元表达载体在延长鲜切花瓶插寿命中的应用。采用前述双元表达载体延长鲜切花瓶插寿命的方法用含有etrl基因的pFGC5941-etrl双元表达载体转化根癌农杆菌LAB4404感受态细胞，采用根癌农杆菌介导的植物转基因方法将Atetrl基因导入鲜切花植物基因组，转化成功后常规培养，即可。与现有技术相比，本专利技术成功的使用拟南芥CS237突变体，克隆显性突变基因etrl构建了双元表达载体，将该载体导入鲜切花后，能有效抑制乙烯信号传导途径中的下游基因表达，使转基因的鲜切花获得对乙烯不敏感的形状，可将鲜切花寿命延长5 10天。附图说明图I是质粒pEASY-Tl-ertrl结构简 图2是质粒pFGC5941结构简图； 图3是质粒pFGC5941-etrl结构简图。具体实施例方式下面结合具体实施方式详细说明本专利技术的技术方案。I、克隆etrl基因 拟南芥etrl突变体编号为CS237，购自拟南芥生物资源中心(The ArabidopsisBiological Resource Center , ABRC),播种于营养钵中，置于温控培养箱中生长，当植物生长到7 11片真叶时，用于RNA的提取。I. I 总 RNA 提取 按TaKaRa的RNAiso Plus试剂盒说明进行以下操作 ①称取100克新鲜植物材料，加入适量的RNAisoPlus试剂，室温静置5分钟； ②12000g、4°C离心5分钟，上清液转移至I.5ml离心管中； ③加入1/5RNAiso Plus体积量的氯仿，振荡混匀，室温静置5分钟； ④12000g、4°C离心15分钟； ⑤将上清液转移至新的I.5ml离心管中，加入与上清液等体积的异丙醇，室温静置10分钟； ⑧12000g、4°C离心10分钟；弃上清液，保留沉淀并加入Iml 75%的乙醇清洗沉淀； ⑦7500g、4°C离心5分钟；弃上清液，吹干乙醇，加入40 μ I O. 1%的DEPC水溶解，电泳检测结果显示28S和18S条带清晰，无降解，总RNA质量较好。1.2cDNA 模板合成 cDNA 合成米用反转录试剂盒(First Strand cDNA Synthesis Kit, ReverTraAce- α -，]，反转录体系及操作步骤如下 在一灭菌的O. 5ml PCR管中，冰上配制如下试剂依次加入总RNA 2. 5 μ I (约I μ g)、I μ I 的 Oligo (dt) 20、RNase free H2O 8· 5 μ 1，总体积 12 μ 1，置于 PCR 仪上 65°C下 5 分钟，取出后再加入下列成份4μ I的5XRT BufferU μ I的dNTPs (IOmM)、I μ L的RNaseinhibitor (IOU),最后加入I μ L的Rever Tra Ace,终体积20 μ L,充分混合后，短暂离心至管底，再在PCR仪上运行下面的程序30°C下10分钟，42°C下40分钟，99°C下5分钟。反应完成后置-20°C保存备用。2、扩增获得etrl基因 RT-PCR 扩增的正向引物序列为(etrlS) :5’ - ttGGCGCGCCaaCTCCCCTTTTCTCCTTCTC-3’，其中GGCGCGCC是添加的酶切位点，tt、aa是添加的保护碱基，CTCCCCTTTTCTCCTTCTC是特异引物序列；反向引物序列为(etrlA):5，- cgGGATCCcgCCTTTACATGCCCTCGTACA_3’，其中GGATCC是添加的酶切位点，eg、eg是添加的保护碱基，CCTTTACATGCCCTCGTACA是特异引物序列，设计扩增的ertl基因片段约2300bp。在一灭菌的O. 5mL PCR管中，依次加入17. 25μ L无菌重蒸水、2· 5μ L的10 XPCR缓冲液、I. 6 μ L 的 dNTP (2. 5mM)、0· 5 μ L 的 etrlS 引物(终浓度 IOpmol)、O. 5 μ L 的 etrlA弓丨物(终浓度IOpmol)、I μ L的cDNA模板和O. 15 μ L Taq DNA聚合酶(5U/ μ L)，总体积25 μ L ；PCR反应条件为预变性94°C、5分钟，接着按以下的温度变化程序循环30次变性940C，保持30秒，退火58°C，保持60秒，延伸72°C，保持60秒；最后于72°C保持10分钟。 电泳检测显示，扩增的基因片段长度与预期相符。本文档来自技高网...

【技术保护点】
含有etr1基因的双元表达载体的构建方法，其特征在于：扩增拟南芥突变体etr1基因并克隆至表达载体pEASY？T1上获得pEASY？T1？etr1质粒，在该质粒的AscI和BamHI限制性内切酶位点用双酶切体系酶切后获得etr1基因片段，用同样的双酶切体系对pFGC5941质粒进行双酶切获得骨架片段，将etr1基因片段和骨架片段用T4？DNA连接酶进行连接，成为环状质粒，得到pFGC5941？etr1双元表达载体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张凌云，王济，贝学军，张一修，钟广炎，
申请(专利权)人：贵州师范大学，
类型：发明
国别省市：