本发明专利技术涉及基因工程领域，具体地涉及一种通过对嗜热真菌Thermomyces?lanuginosus?DSM10635的耐热木聚糖酶1YNA基因进行体外定点突变而得到的一种突变酶。本发明专利技术具体提供了该突变酶的氨基酸序列以及编码该突变酶的基因序列，本发明专利技术同时还提供了突变酶的制备方法以及该突变酶的用途。本发明专利技术所获的突变酶具有以下性质：以燕麦木聚糖作为底物时，最适pH6.5，最适温度75℃，比活为7183.54U/mg；对蛋白酶具有优良的抗性；易于工业化发酵生产。该突变酶热稳定性较原始酶1YNA显著提高，可广泛用于食品，饲料，酒精发酵，纸浆造纸等领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，具体地，本专利技术涉及一种耐热木聚糖酶IYNA基因的定点突变、组氨酸标记，同时还包含重组载体及其应用。
技术介绍
木聚糖是一种多聚五碳糖，主链是由多个吡喃木糖基通过1，4-木糖苷键相连，侧链上连着多种大小不同的短的取代基。阿拉伯木聚糖的取代降低了主链化学键的作用力，从而使其具有水溶性和粘稠性，侧链数量越多，阿拉伯糖基的取代程度越高，水分子越容易渗入，溶解度就越大。根据溶解性可将木聚糖分为水溶性木聚糖(25% 30%)和不溶性木聚糖两大类(约占70% 75%)。 木聚糖主要存在于植物细胞的次生壁上，处于木质素和其它多聚糖之间，起着连接作用。木聚糖在各种饲料原料中普遍存在，是饲料中最主要的抗营养因子之一。它能够增加肠道食糜黏度，影响动物消化吸收；影响消化道内源酶活性，刺激消化器官代偿性增大；影响脂肪的消化吸收；促使肠道有害微生物的增殖，影响动物健康；作为植物细胞的物理屏障作用，影响养分的消化。木聚糖酶是一组可将木聚糖降解成低聚糖和木糖的复合酶系。木聚糖酶类专一降解木聚糖，具有很大的商业开发价值。饲料工业中添加木聚糖酶可以为畜禽生产带来良好的生产效果和经济效益。木聚糖酶广泛经济高效的应用于饲料工业应具备一定条件。例如，猪胃中的PH—般为2 3. 5，十二指肠、空肠和回肠的pH范围分别为4飞、5. 5飞.7和7.(Γ7. 5，因此要求饲用木聚糖酶在pH较广的范围内能保持较高的活性。另一方面，现在颗粒料制粒过程中有一个短暂的高温过程，温度在75、3° C，多数木聚糖酶在此高温下会大幅度地丧失活性；同时，饲料中的木聚糖酶最终的作用场所是猪正常体温的胃肠中(37° C)，因此能耐制粒高温，且在动物正常体温下具有较高活性成为木聚糖酶在生产中应用的关键。越来越多的木聚糖酶已经广泛应用于工业生产。在使用酶制剂的工业生产中，高温过程常常不可避免或对工艺有帮助，所以耐高温高碱木聚糖酶的应用前景极其广阔。基于PCR技术的不断发展和完善，运用基因工程和蛋白质工程的方法对木聚糖酶进行定向改造，可以得到预期功能的应用酶。许多关于木聚糖酶分子突变的研究表明，定点突变改变氨基酸残基能导致酶的某些特异性的改变。来源于嗜热真菌T. Ianuginosus DSM10635的木聚糖酶,经研究显示,其为一种较耐高温的第11家族木聚糖酶，等电点为3. 7，最适pH为6. 5，最适温度为70° C，在pH 5.5-9范围内都具有很高的酶活性。另外质谱结果表明嗜热真菌T. Ianuginosus DSM 10635所产木聚糖酶的分子量为21295. 17 Da，与嗜热真菌T. Ianuginosus DSM 5826所产木聚糖酶(IYNA)分子量极为相近，酶学性质相似，故推测这两株菌所产木聚糖酶基因序列应具有较高一致性。如何在此基础上进一步提高木聚糖酶的最适温度，使其更好的满足食品工业中的高温要求，是本领域内目前研究的热点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高耐热性的木聚糖酶IYNA的突变酶，并将该突变酶命名为DSB1，该突变酶DSBl的氨基酸序列如下MDcGtpnsegwhdgyyyswwsdggacatytnleggtyeiswgdggnlvggkgwnpglnaraihfegvyqpngnsylavygwtrnplveyyivenfgtydpssgatdlgtvecdgsiyrIgkttrvnapsidgtqtfdqywsvrqdkrtsgtvqtgchfdawaraglnvngdhyyqivategyfssgyaritvadvgELEHHHHHH该突变酶DSBl共由205个氨基酸组成，其理论分子量为22. 6 kDa，等电点为5. 07。本专利技术同时还提供了编码上述突变酶DSBl的基因，其核苷酸序列如下atggattgcgcaacccccaactcggagggctggcacgatggttattactattcctggtggagtgacgg tggagcgtgcgccacgtacaccaacctggaaggcggcacctacgagatcagctggggagatggcggtaacctcgtcggtggaaagggctggaaccccggcctgaacgcaagagccatccactttgagggtgtttaccagccaaacggcaacagctaccttgcggtctacggttggacccgcaacccgctggtcgagtattacatcgtcgagaactttggcacctatgatccttcctccggtgctaccgatctaggaactgtcgagtgcgacggtagcatctatcgactcggcaagaccactcgcgtcaacgcacctagcatcgacggcacccaaaccttcgaccaatactggtcggtccgccaggacaagcgcaccagcggtaccgtccagacgggctgccacttcgacgcctgggctcgcgctggtttgaatgtcaacggtgaccactactaccagatcgttgcaacggagggctacttcagcagcggctatgctcgcatcaccgttgctgacgtgggcgaactcgagcaccaccaccaccaccactga，共由 618 个减基组成。本专利技术中所涉及的定点突变方法如下采用重叠延伸PCR进行突变，突变反应总共分两步，首先是扩增突变位点两端序列，得到相互之间有重叠片段的两组PCR产物，然后将两组PCR产物作为模板进行下一轮PCR扩增，得到需要的目的片段，并完成测序。本专利技术同时提供了一种包含有上述突变酶DSBl基因序列的重组载体，其中原核表达载体为pET-22b (+)，将上述重组载体命名为pET-22b (+) -dsbl。本专利技术还提供了一种包含有上述突变酶基因序列的重组菌株，宿主细胞为大肠杆菌Escherichia coli BL21 (DE3)，并将获得的重组菌株命名为BL21/dsbl。本专利技术还提供了制备上述木聚糖酶IYNA的突变酶DSBl的方法，采用以下步骤(I)、用包含有上述基因的重组载体转化宿主细胞，制得重组菌株，其中重组载体中原核表达载体为pET-22b(+)，宿主细胞为大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3) ; (2)、培养重组菌株，诱导突变酶表达；(3)将表达后的突变酶回收并采用亲和层析纯化制得突变酶。。本专利技术在基因水平上，采用重叠延伸PCR技术对木聚糖酶IYNA完成定点突变和组氨酸标记的添加，获得了成熟的突变酶DSB1，该突变酶DSBl在原核表达体系条件下，较原始木聚糖酶酶IYNA的热稳定性显著提高，其最适温度为75° C，较原始酶提高了约10° C，最适pH 6. 5，比活力为7183. 54 U/mg ；本专利技术提供的木聚糖酶突变酶DSB1，由于其热稳定性大幅提高，性质优良，适合于在动物饲料、食品工业中应用。该突变酶DSBl可应用到饲料添加剂当中，对畜牧业的发展有着重要的意义。该突变酶DSBl在工业中也能够发挥出极大的作用。附图说明图I为重叠延伸PCR工艺的流程图；图2木聚糖酶IYNA与突变酶DSBl的最适反应温度对比图；图3木聚糖酶IYNA与突变酶DSBl的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种木聚糖酶1YNA的突变酶，其特征在于：所述的突变酶的氨基酸序列如SEQ？ID？NO？2所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：熊海容，王亚伟，
申请(专利权)人：武汉三合益生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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