重组鲫鱼MBSP表达菌株及其构建方法技术

本发明专利技术提供一种重组鲫鱼MBSP表达菌株，所述表达菌株以巴斯德毕赤酵母GS115为宿主菌，并含有重组酵母表达载体pPIC9K-MBSP；且该重组酵母表达载体pPIC9K-MBSP通过将鲫鱼MBSP基因插入酵母表达载体pPIC9K中构建；并提供了该重组鲫鱼MBSP表达菌株的构建方法。本发明专利技术所构建的表达菌株可分泌表达重组鲫鱼MBSP，且具有表达量高、构建工艺简单、生产成本较低的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及重组微生物
，尤其一种重组鲫鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(MBSP)表达菌株及其构建方法。
技术介绍
鱼类中肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(MBSP)是一种弱碱性蛋白酶，普遍存在于鱼类的肌肉中，该酶对肌原纤维中肌球蛋白重链(myosin heavy chain, MHC)降解的最适温度在55°C左右，在同样条件下α -辅肌动蛋白、肌动蛋白和原肌球蛋白也被不同程度降解。通过对不同种类鱼的MBSP的酶学性质研究发现，MBSP是一种类胰蛋白酶类的蛋白酶，它可以特异地识别精氨酸或赖氨酸残基的羧基末端而对蛋白质进行降解，而其热稳定性优于胰蛋白酶，该酶最适温度为55°C，在25 60°C下加热30 min后，其酶活仍保留在80%以上。目前，在蛋白质的质谱鉴定中，常用胰蛋白酶将蛋白质降解为小肽后进行质谱分析，获·得该蛋白质的肽指纹图谱。由于MBSP与胰蛋白酶具有类似的酶切位点，且其热稳定性优于胰蛋白酶，因此，MBSP有望开发为蛋白质质谱鉴定中的工具酶，具有很好的应用前景和商业价值。肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(MBSP)最早是在1997年由Osatomi等人从淡水鲤鱼ifyprinus carpi ο)肌肉中纯化得到的；2000年，Cao等在海水鱼狗母鱼肌肉中也分离得到了 MBSP ;同年Sangorrin等在老鼠骨骼肌中也发现了一种类似的肌原纤维蛋白结合的丝氨酸蛋白酶；随后，Cao等分别在白鲢鱼与鲫鱼的肌肉中也发现了 MBSP，并对其酶学性质进行了系统研究，充分证明了 MBSP与胰蛋白酶具有类似的功能，从而为MBSP的应用开发提供了理论依据；2009年,Guo等获得了鲫鱼(Parsssius auratus) MBSP的cDNA序列,这为鲫鱼MBSP的外源表达提供了有用的信息鲫鱼MBSP含有一个729碱基对的开放阅读框，它编码带有20个氨基酸信号肽的含242个氨基酸的蛋白质，其成熟蛋白的核苷酸序列为669bp，编码222个氨基酸。现有MBSP通常都是从肌肉中纯化得来的，而天然MBSP在肌肉中含量很低，纯化工艺复杂，生产成本很高，无法得以较为广泛地应用。为此，有必要利用基因工程技术高效表达MBSP,从而降低生产成本、有利于大规模生产。因此，本领域迫切需要提供一种表达量高、构建工艺简单、生产成本较低的表达菌株用于表达具有生物学活性的重组鲫鱼MBSP。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种重组鲫鱼MBSP表达菌株及其构建方法，具有表达量高、构建工艺简单、生产成本较低的特点。本专利技术是通过以下技术方案解决上述技术问题的 一种重组鲫鱼MBSP表达菌株，所述表达菌株以巴斯德毕赤酵母GS115为宿主菌，并含有重组酵母表达载体PPIC9K- MBSP ;且该重组酵母表达载体pPIC9K- MBSP通过将鲫鱼MBSP基因插入酵母表达载体pPIC9K中构建。一种上述重组鲫鱼MBSP表达菌株的构建方法，包括如下步骤根据编码鲫鱼MBSP的cDNA序列设计合成一对特异性引物SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3，以鲫鱼肌肉细胞中的总RNA为模板，通过RT-PCR方法扩增鲫鱼MBSP基因片段，将PCR产物和载体pPIC9K分别用限制性内切酶I和I进行双酶切后，用DNA连接酶连接，将鲫鱼MBSP基因片段定向插入到PPIC9K载体的限制性内切酶说oR I和Afoi I之间，获得的连接产物即为重组酵母表达载体PPIC9K- MBSP，接着将重组酵母表达载体pPIC9K- MBSP用Sal I内切酶线性化后，转化巴斯德毕赤酵母GS115的感受态细胞，用含G418的YPD抗性平板筛选高拷贝的阳性转化子，获得重组鲫鱼MBSP表达菌株。进一步地，利用甲醇诱导所构建的重组鲫鱼MBSP表达菌株。本专利技术的有益效果在于构建获得的重组鲫鱼MBSP表达菌株GS115/pPIC9K-MBSP可进行高效分泌表达鲫鱼MBSP，既具有原核系统的简单，又具有真核系统的表达后修饰(如糖基化等)，生产工艺简单，产品纯度高、活性高；另外，利用发酵罐进行工业化生产后，可大量获得目的产物，为重组鲫鱼MBSP的特性研究及将其作为蛋白质质谱鉴定的工具酶的研制奠定基础。 附图说明下面参照附图结合实施例对本专利技术作进一步的描述。图I为本专利技术中重组表达质粒PPIC9K-MBSP的构建示意图。图2为本专利技术中PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测图。图3为本专利技术中重组表达质粒PPIC9K-MBSP酶切鉴定的琼脂糖电泳检测图。图4为本专利技术中重组鲫鱼MBSP表达菌株菌落PCR鉴定的琼脂糖电泳检测图。图5为本专利技术中重组鲫鱼MBSP表达菌株用甲醇诱导后培养基上清的SDS-PAGE检测图(15%的分离胶，用靠马斯亮蓝染色)。图6为本专利技术中重组鲫鱼MBSP的最适温度和温度稳定性测定结果曲线图。图7为本专利技术中重组鲫鱼MBSP的最适pH和pH稳定性测定结果曲线图。具体实施例方式一、重组鲫鱼MBSP表达菌株的构建 (I)鲫鱼MBSP基因片段(MBSP)的获取 依照GenBank上登录的鲫鱼MBSP的cDNA序列(登陆号DQ872434)设计PCR引物，用来扩增成熟鲫鱼MBSP基因片段(去掉其自身的信号肽)。引物序列为Pl :5’ -TAGAATTCATCATTGGTGGTTAGGAGTGTAGG-3> (SEQ ID NO. 2)；P2 :5’ -TAGCGGCCGCTTAGTTACTAGCTAATGGTGG-3，(SEQ ID NO. 3)； 其中Pl中的下划线部分为&oR I酶切位点，且P2中的下划线部分为Afoi I酶切位占. 以鲫鱼肌肉细胞的总RNA为模板，用以上两条引物，采用RT-PCR方法扩增目的基因卿成熟鲫鱼MBSP基因片段)； 反转录体系(20 μυ:总 RNA 5 μ , Oligo (dT) I μ ,M-MLV 5XReaction Buffer 4 μ ,dNTP Mixture (10 mol/L) 2 μ , M-MuLV RT (100 U/μ I μ , RNase Inhibitor (40 U/μι) O. 5 μ , DEPC H2O 6. 5 μ (均购自纽英伦生物技术北京分公司)； 反转录反应条件为42°C温育30 min ； PCR 反应体系(50 PL):以上反转录产物(cDNA) 2. O μ , Pl (10 pmol/uL) 2. O μ ,Ρ2 (10 pmol/uL) 2. O M-L, dNTP Mixture (10 mol/L) 4. 0 M-L, IOXEx Taq buffer 5. 0 M-L,Ex Taq酶(λ 25 μ ，无菌水34. 75 μ (均购自TaKaRa大连分公司)； 扩增条件94°C预变性5 min ;然后94°C变性30 s，50°C退火30 s，72°C延伸60 S，共循环30次；再于72°C延伸7 min。将PCR产物于I. 0%琼脂糖凝胶中进行电泳检测，结果显示扩增片段约700 bp左右(如图2所示，该图中泳道M为DL2000 DNA Marker ;泳道I为PCR产物)，即PCR产物位于500 bp与750 bp之间，符合成熟鲫鱼MBSP基因片本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组鲫鱼MBSP表达菌株，其特征在于：所述表达菌株以巴斯德毕赤酵母GS115为宿主菌，并含有重组酵母表达载体pPIC9K？？MBSP；且该重组酵母表达载体pPIC9K？？MBSP通过将鲫鱼MBSP基因插入酵母表达载体pPIC9K中构建。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杜翠红，曹敏杰，韩龙，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：