本发明专利技术公开一种应用于大豆下胚轴外植体转化受体系统的农杆菌局部侵染的装置和侵染方法。为了抑制外植体表面的农杆菌在培养基上的过旺增殖以防止植物材料的腐烂并且不使用抗生素，本发明专利技术提供了一种设计简单的装置成功应用于大豆下胚轴外植体转化受体系统的农杆菌侵染，避免把整个外植体浸泡在农杆菌菌液中，只对有再生不定芽潜能的下胚轴上端切口附近进行农杆菌侵染处理。本发明专利技术进一步对侵染方法条件进行了优化。应用本发明专利技术可以降低大豆下胚轴外植体遗传转化受体系统的药剂成本和提高转化工作效率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于遗传工程
，具体涉及一种应用于大豆下胚轴外植体转化受体系统的农杆菌局部侵染方法。
技术介绍
植物遗传转化是一种重要和先进的育种技术。目前，植物遗传转化的技术已经基本成熟，而最为通常的转化方法是应用农杆菌介导法将外源基因导入到受体植物的细胞并整合到染色体基因组中以实现外源基因稳定的遗传。在采用农杆菌转化大豆下胚轴外植体的过程中，以往都是把外植体整个浸泡在农杆菌菌液中，使整个外植体都沾上菌液。为了抑制外植体表面的农杆菌在培养基上的过旺增殖以防止植物材料的腐烂，通常是在培养基中添加抗生素。但是，抗生素在抑制农杆菌增 殖的同时也对外植体不定芽再生产生不利影响。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是针对现有农杆菌转化大豆下胚轴外植体的技术不足，提供一种应用于大豆下胚轴外植体转化受体系统的农杆菌局部侵染的装置，该装置可以有效保证部分外植体粘上菌液并避免整个外植体都沾上菌液。本专利技术的另一个目的是提供一种新的应用于大豆下胚轴外植体转化受体系统的农杆菌局部侵染方法，本专利技术一方面基于本专利技术上述装置，只对有再生不定芽潜能的下胚轴外植体的形态学上端切口附近进行局部的农杆菌侵染处理。因为经过局部侵染处理后农杆菌仅存在于外植体上端切口附近，在不定芽再生的培养过程中外植体上端切口附近不需要接触培养基，因此不需要在培养基中添加旨在抑制农杆菌的抗生素。避免了抗生素在抑制农杆菌增殖的同时也对外植体不定芽再生产生的不利影响，另一方面，本专利技术方法对侵染的关键步骤和工艺进行了优化，适宜的装置以及步骤和工艺的优化最终保证了本专利技术良好的转化效率。本专利技术通过以下技术方案实现上述专利技术目的 本专利技术首先提供一种应用于大豆下胚轴外植体转化受体系统的农杆菌局部侵染的装置，包括培养皿及培养皿盖，在培养皿中固定有一基板，基板上设置有贯通柱孔，所述贯通柱孔至少下端伸出基板并保证其下端底部与培养皿底距离为I mm 2 mm;所述贯通柱孔的孔内径大小与外植体茎径大小相适配。所述装置可置于高压蒸汽灭菌锅中进行常规灭菌。所述贯通柱孔可以为若干个。作为优选，本专利技术所述装置包括培养皿及培养皿盖，在培养皿中固定有一块通常用于核苷酸片段扩增的PCR板，切掉PCR板底部的小管形成贯通柱孔(整齐地切掉PCR板底部的小管)，保留四个角上的小管作支架，支架将PCR板支撑在培养皿中。根据实验室常用的培养皿大小和PCR板大小，本专利技术采用4cmX 6cm的PCR板。基于上述装置，本专利技术同时提供一种应用于大豆下胚轴外植体转化受体系统的农杆菌局部侵染方法，具体包括以下步骤 (I)制备用于局部侵染处理下胚轴外植体的农杆菌菌液； 作为优选，用已灭菌的接种环从保存有农杆菌菌种的小管中蘸取少许菌液，在固体培养基上划线接种之后，把培养皿放置于28°c生化恒温培养箱培养3天，待培养基上长出单菌落后，再用接种针挑取单菌落接种至盛有20mL液体农杆菌培养基的大离心管(已灭菌)中，恒温摇床(28°C，200rpm)上培养24小时后，12000rpm离心lOmin，保留沉淀倒掉上清液，再向大离心管中加入20mL液体共培养基，悬浮沉淀，恒温摇床(28°C，200rpm)中培养I小时，调整菌液的OD值为O. 5 1.0。所述农杆菌培养基5 g/L牛肉浸膏+lg/L酵母膏+5 g/L蛋白胨+5 g/L鹿糖+0. 4g/100 mL MgSO4 · 7H20，用 I mg/L NaOH 溶液调整 pH 至 7. 4。培养基在 121 °C, O. I MPa 的条件下灭菌15 min，待培养基冷至60 °C左右时，加入经过孔径为O. 22微米滤膜过滤灭菌 的100 mg/mL氯霉素母液和50 mg/mL的卡那霉素母液,使两者终浓度分别为100 mg/L和50 mg/L;其中固体培养基中加入7 g/L琼脂。所述液体共培养基:MS培养基配方的无机成分(16. 5 g/L硝酸铵、19 g/L硝酸钾、1.7g/L磷酸二氢钾、3. 7 g/L七水硫酸镁、4. 4 g/L二水氯化钙、16. 9 mg/L—水硫酸锰、8. 6mg/L七水硫酸锌、6. 2 mg/L硼酸、O. 83 mg/L碘化钾、O. 25 mg/L二水硫酸钥二钠、O. 025 mg/L五水硫酸铜、O. 025 mg/L六水氯化钴、37. 3 mg/L 二水乙二胺四乙酸钠、27. 8 mg/L七水硫酸亚铁)+B5培养基配方的有机成分(10 mg/L盐酸硫胺素、I mg/L盐酸卩比卩多醇、I mg/L烟酸、100 mg/L肌醇)+500 mg/L水解络蛋白+30 g/L鹿糖+100 mg/L乙酰丁香酮,用I mg/LNaOH溶液调整pH至5. 5。培养基在121 °C, O. I MPa的条件下灭菌15 min，待培养基冷却至60°C左右时，加入经过孔径为O. 22微米滤膜过滤灭菌的100 mg/mL乙酰丁香酮母液，使其终浓度为100 mg/L。(2)获取大豆下胚轴外植体供体材料和下胚轴外植体； 作为优选，选取大小均一的成熟大豆种子，经常规灭菌后，接种至无激素MSB5培养基上，在室温为25 °C、光照强度为2000 lx、光照时间为每天12小时的条件下培养5天，获得具有长度大于I cm的胚轴的大豆幼苗作为下胚轴外植体供体材料，对幼苗进行切割，获取长度为I cm左右的下胚轴切段为外植体，切口平齐。所述MSB5培养基MS培养基配方的无机成分(16. 5 g/L硝酸铵、19 g/L硝酸钾、1.7g/L磷酸二氢钾、3. 7 g/L七水硫酸镁、4. 4 g/L 二水氯化钙、16. 9 mg/L—水硫酸锰、8.6mg/L七水硫酸锌、6. 2 mg/L硼酸、O. 83 mg/L碘化钾、O. 25 mg/L二水硫酸钥二钠、O. 025mg/L五水硫酸铜、O. 025 mg/L六水氯化钴、37. 3 mg/L 二水乙二胺四乙酸钠、27. 8 mg/L七水硫酸亚铁)+B5培养基配方的有机成分(10 mg/L盐酸硫胺素、I mg/L盐酸卩比卩多醇、I mg/L烟酸、100 mg/L肌醇)+25 g/L蔗糖+300 mg/L蛋白胨+7 g/L琼脂，用I mg/L NaOH溶液调整pH至5. 8 6. O。培养基在121 °C >O. I MPa的条件下灭菌15 min。(3) BA溶液处理下胚轴外植体； 作为优选，在超净工作台上，把切好的下胚轴外植体逐个插入本专利技术所述的装置的各个贯通柱孔中，使外植体的形态学上端朝下(接触培养皿底)，然后向该装置组成部分的培养皿中倒入30 mg/L BA处理溶液至约I mm深度，盖上培养皿盖，静置20 min后倒掉BA溶液，取出下胚轴外植体，放置在无菌吸水纸上，吸去外植体表面残留的BA溶液。所述BA处理溶液的配制准确称取一定量的分析纯BA药品，用I mg/L NaOH充分溶解，再用去离子水定容，配制成30 mg/L的BA处理溶液。采用I mg/L HCl调整pH值为5. 8 6. O ;在121°C、0. I MPa的条件下，对已配制好的高浓度的BA处理溶液进行15 min灭菌。(4)对下胚轴外植体进行农杆菌侵染前的预培养； 作为优选，把经过步骤(3) BA溶液短期处理后的外植体以竖插方式(外植体的形态学上端朝上)接种至无激素本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种应用于大豆下胚轴外植体转化受体系统的农杆菌局部侵染的装置，其特征在于包括培养皿和培养皿盖，在培养皿中固定有一基板，基板上设置有贯通柱孔，所述贯通柱孔至少下端伸出基板并保证其下端底部与培养皿底距离为1mm～2mm；所述贯通柱孔的孔内径大小与外植体茎径大小相适配。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨跃生，刘颖，张奇，于磊，郭振飞，年海，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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