本发明专利技术提供一种荷叶中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，通过磁珠分离和液相色谱-质谱联用分析方法从荷叶中筛选获得9个具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，经过α-葡萄糖苷酶抑制活性验证，确认获得的化合物具有α-葡萄糖苷酶抑制活性。与传统方法相比，初筛无须制备分离化合物，显著提高了筛选效率、缩短了筛选时间。将先分离后筛选的传统活性筛选模式改进为先筛选鉴定后分离的新型活性筛选模式，大大减少了化合物制备分离的盲目性。可推广应用于天然药物或中药混合物中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物的快速筛选。获得的化合物可在制备抗糖尿病药物中应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于药物筛选方法领域，涉及一种荷叶中具a -葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，尤其涉及应用磁珠分离和液相色谱-质谱联用定性从荷叶中筛选得到具有a-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，并在制备治疗糖尿病药物中的应用。
技术介绍
糖尿病是一种慢性代谢紊乱性疾病，其主要的干预方法是控制饮食、减少摄入性碳水化合物的含量、药物治疗等。人体摄入的碳水化合物经过小肠上皮细胞的酶(如淀粉酶和a-葡萄糖苷酶)的水解作用生成葡萄糖之后，才被吸收进入血液循环。阿卡波糖等 a -葡萄糖苷酶抑制剂可以抑制a -葡萄糖苷酶，减少碳水化合物转化成葡萄糖，是一类临床常用的糖尿病治疗药物。现有的a-葡萄糖苷酶抑制剂筛选方法主要采用体外酶活性抑制实验，仅能对纯化合物的活性进行评价，难以用于中药等复杂混合物中a-葡萄糖苷酶抑制剂的发现。亲和选择技术联用质谱分析方法可以快速分析与鉴定与特定蛋白或酶结合的配体化合物，如将特定蛋白或酶加入待筛选的样品中使用超滤膜把蛋白结合物与未结合的化合物分离开，再进行质谱检测；或是把特定蛋白或酶固定在色谱固定相中，使用洗脱溶剂把化合物按照与蛋白的结合强弱依次洗脱下来，进行质谱检测；还可将特定蛋白或酶固定在某种合适的载体上，与配体化合物作用后，把不结合的化合物洗脱掉，然后把与酶结合的化合物洗脱出来，进行质谱检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供荷叶中具a -葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，是利用磁珠分离联用液质定性的快速筛选方法获得，通过以下步骤实现:2:将空白羧基磁珠用I-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液活化；在活化磁珠中，加入a-葡萄糖苷酶溶液及2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液，振荡孵育一段时间后使a-葡萄糖苷酶键合于空白羧基磁珠上；:！:对酶键合磁珠进行电镜分析、磁力测试和红外分析考察键合磁珠质量；$在酶键合磁珠中加入荷叶提取物水溶液，振荡孵育一段时间后，移去孵育液，将a-葡萄糖苷酶键合磁珠洗脱液进行液质联用定性分析，筛选获得具a-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物；⑩分离制备化合物并进行a-葡萄糖苷酶抑制活性验证。具体的步骤如下 I.制备键合a-葡萄糖苷酶的磁珠 (I)磁珠活化取磁珠使用2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液清洗后加入I-乙基-3-(3- 二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液混合均匀，孵育活化30min后移去上清液，并用2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液清洗；(2)磁珠键合在活化的磁珠上，加入含a -葡萄糖苷酶的2- (N-吗啡啉)乙磺酸溶液，震荡混合均匀，在室温孵育30min进行包被，移去上清液，再用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗包被的磁珠4次，弃去清洗液，待用。(3)键合磁珠质量考察将制备的键合磁珠分散在PBS溶液中，使用扫描式电子显微镜对空白磁珠、a -葡萄糖苷酶键合磁珠的表面分别分析，检查酶键合情况。采用傅里叶变换红外光谱仪，测定空白磁珠、a-葡萄糖苷酶、a -葡萄糖苷酶键合磁珠的红外光谱，检查酶结合情况。采用磁强计数仪考察键合磁珠的磁力变化情况。2.筛选具a-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物 (I)具潜在a -葡萄糖苷酶抑制活性的化合物初筛取100 U I荷叶提取物水溶液2份，分别加到Iml分散于醋酸铵溶液的键合a-葡萄糖苷酶的磁珠和空白磁珠，放在振荡器上混匀，孵育I h。弃去上清液，再加入Iml醋酸铵溶液清洗2次，弃去清洗液，最后使用含10%乙腈的醋酸铵溶液洗脱，吸取洗脱液备用，平行操作三份，取空白磁珠和酶键合磁珠的洗脱液进行液相色谱-质谱联用分析。 (2)目标化合物获取及活性验证 采用常规柱色谱分离技术分离获取目标化合物群，再采用制备液相色谱分离、纯化目标化合物或购置目标化合物标准品 采用酶抑制活性实验验证纯化的目标化合物是否具有a-葡萄糖苷酶抑制活性，计算其半数抑制浓度。本专利技术提供的荷叶中具a-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物的结构通式如下 ^r°H sVy^or3 OH O 所述化合物有Ll-9 :槲皮素3-0-阿拉伯糖基-(I — 2)-半乳糖苷、芦丁、槲皮素-3-0-0-D-葡萄糖醛酸苷、异鼠李素-3-0-鼠李糖基-(I — 6)-葡萄糖苷(水仙苷)、山奈酚-3-0-P-D-葡萄糖醛酸苷、异鼠李素-3-0-P-D-葡萄糖醛酸苷、异鼠李素-3-0- ^ -D-木糖基-(I — 2) - P -D-葡萄糖苷、异鼠李素-7-0- ^ -D-葡萄糖醛酸苷和槲皮素。本专利技术的另一个目的是提供从荷叶中筛选获得的具a-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物在制备抗糖尿病药物中的应用。本专利技术利用磁珠分离联用液质定性的快速筛选技术，筛选获得了荷叶中具a-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，与传统方法相比，初筛无须制备分离化合物，显著提高了筛选效率、缩短了筛选时间。将先分离后筛选的传统活性筛选模式改进为先筛选鉴定后分离的新型活性筛选模式，大大减少了化合物制备分离的盲目性。可推广应用于天然药物或中药混合物中具有a-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物的快速筛选。本专利技术获得的荷叶中具a-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物可在制备抗糖尿病药物中应用。附图说明图I是空白磁珠、a -葡萄糖苷酶、酶键合磁珠红外光谱图。图2是基于磁珠分离的荷叶中活性成分筛选流程图。图3是a -葡萄糖苷酶键合磁珠洗脱液的液相色谱图。具体实施例方式下面将结合附图和实施例进一步说明本专利技术的实质内容及有益效果，该实施例仅用于说明本专利技术而非对本专利技术的限制。实施例所用仪器液质联用仪；傅里叶变换红外光谱仪；磁强计数仪；酶标仪 实施例I键合a-葡萄糖苷酶的磁珠制备 I.试剂及溶液配制 a_ 葡萄糖苷酶(Saccharomyces cerevisiae, simga 公司);竣基磁珠Dynabeads®MyOne Carboxylic Acid,规格10 mg/ml (invitrogen 公司);I-乙基 _3_ (3_ 二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC, sigma公司)；2_(N_吗啡啉)乙磺酸(MES, sigma公司)；N_轻基琥拍酰亚胺(NHS, sigma公司)。25 mmol/L的MES溶液配制称取MES适量，加水溶解，加lmol/L氢氧化钠溶液调pH至6,制成浓度为25mmol/L的MES溶液。50 mg/ml EDC溶液配制称取EDC适量，快速溶解在冷的25mmol/L的MES溶液中，制成浓度为50mg/ml的EDC溶液。临用时新鲜配制。50 mg/ml NHS溶液配制称取NHS适量，快速溶解在冷的25mmol/L的MES溶液中，制成浓度为50 mg/ml的NHS溶液。临用时新鲜配制。lmg/ml a-葡萄糖苷酶溶液配制称取a -葡萄糖苷酶I mg，快速溶解在冷的25mmol/L的MES溶液中，制成浓度为I mg/ml的a -葡萄糖苷酶溶液。临用时新鲜配制。10 mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)配制称取磷酸二氢钠适量，加水溶解，制成浓度为10 mmol/L的磷酸二氢钠溶液，另称取磷酸氢二钠适量，加水溶解，制成浓度为10 mmol/L的磷酸氢二钠溶液。量取10 mmol/L的磷酸二氢钠溶液81. 5 ml与磷酸氢二钠溶液18. 5ml，混匀即得。2、键合a-葡萄糖苷酶的磁珠的制备 磁珠活化取本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种荷叶中具α？葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，其特征在于，通过以下步骤实现：（1）制备键合α？葡萄糖苷酶的磁珠（a）磁珠活化：取磁珠使用2？(N？吗啡啉)乙磺酸溶液清洗后加入1？乙基？3？(3？二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液和N？羟基琥珀酰亚胺溶液混合均匀，孵育活化30min后移去上清液，并用2？(N？吗啡啉)乙磺酸溶液清洗；（b）磁珠键合：在活化的磁珠上，加入含α？葡萄糖苷酶的2？(N？吗啡啉)乙磺酸溶液，震荡混合均匀，在室温孵育30min进行包被，移去上清液，再用磷酸缓冲液清洗包被的磁珠，弃去清洗液，待用；（c）键合磁珠质量考察：将制备的键合磁珠分散在磷酸缓冲液中，使用扫描式电子显微镜对空白磁珠、α？葡萄糖苷酶键合磁珠的表面分别分析，检查磁珠键合情况，采用傅里叶变换红外光谱仪，测定空白磁珠、α？葡萄糖苷酶、α？葡萄糖苷酶键合磁珠的红外光谱，检查酶结合情况，采用磁强计数仪考察键合磁珠的磁力变化情况；（2）筛选具α？葡萄糖苷酶抑制活性的化合物（a）具α？葡萄糖苷酶抑制活性的化合物初筛：取100？μl荷叶提取物水溶液2份，分别加到1ml？分散于醋酸铵溶液的键合α？葡萄糖苷酶的磁珠和空白磁珠，分别放在振荡器上混匀，孵育1？h，弃去上清液，用醋酸铵溶液清洗，最后用含10%乙腈的醋酸铵溶液洗脱，取空白磁珠和酶键合磁珠的洗脱液进行液相色谱？质谱联用分析；（b）目标化合物获取及活性验证：采用常规柱色谱分离技术分离获取目标化合物群，再采用制备液相色谱分离、纯化目标化合物或购置目标化合物标准品；采用酶抑制活性实验验证纯化的目标化合物是否具有α？葡萄糖苷酶抑制活性，计算其半数抑制浓度。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：程翼宇，王毅，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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