本发明专利技术公开了壳聚糖在制备流感病毒减毒活疫苗中的应用，提供了一种能够减少流感病毒减毒活疫苗用量的佐剂。本发明专利技术首次采用壳聚糖作为流感病毒减毒活疫苗佐剂，能够增强疫苗的免疫原性，诱导机体更强的免疫应答，有效的减少疫苗的用量，在现有的生产能力和技术下，能够有效扩大免疫人群，在流感大流行时具有重要的社会意义和使用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物制品领域，更具体地讲，涉及一种能够减少流感病毒减毒活疫苗用量的佐剂。
技术介绍
流行性感冒病毒(influenza virus)是一种常见的急性呼吸道传染病，易于发生抗原漂移和抗原转变，并且传染性极强，严重危害人类的健康和生命。疫苗接种是预防流感病毒感染的最有效的方式之一。但是，目前流感疫苗的生产能力和技术有限。在2009 年-2010年的甲型流感病毒HlNl大流行期间，据世界卫生组织数据更新，到2010年11月为止，世界上有77个国家共获得了仅仅7800万支疫苗，而且所有这些疫苗都是在第二波流感发生之后才送到的，这远远难以满足人类的需求。佐剂可提高疫苗的免疫应答水平并降低疫苗使用剂量，在疫苗中使用佐剂有可能解决疫苗供应不足的问题。因此需要研究一些新的佐剂，通过增加疫苗的免疫原性，减少疫苗免疫的剂量，从而扩大免疫的人群。但是目前批准的应用于人体上的佐剂只有铝佐剂和MF59两种，难以满足疫苗的需求。已经有研究表明壳聚糖作为佐剂能够在动物模型中增强疫苗的系统性和局部性免疫应答。壳聚糖广泛的存在于自然界中，由几丁质经过脱乙酰作用得到，化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖，具有无毒性、生物粘附性、生物降解性等特性，且对人体无刺激性和过敏反应，是一种安全可靠的天然活性物质在医药、食品、化工、化妆品、水处理、金属提取及回收、生化和生物医学工程等诸多领域的应用研究取得了重大进展。美国食品药品监督管理局已经批准壳聚糖应用于食品和药品中。因此，壳聚糖作为流感病毒减毒活疫苗的佐剂具有重要的应用价值。我们以前的研究《流感病毒灭活疫苗新型佐剂——壳聚糖增强免疫作用研究》(常海燕，陈建军等，中国生物制品学杂志，2004年06期)表明将壳聚糖与流感病毒灭活疫苗混合经腹腔免疫BALB c小鼠，间隔3周，免疫2次。免疫后取血清，检测血清中所产生的IgG、IgGl、IgG2a等抗体水平，同时，取小鼠鼻洗液检测IgA抗体；加强免疫后I周，用致死性(40LD50 )流感病毒A PR 8 34 (HlNl)攻击小鼠，观察小鼠的体重变化和保护作用。结果表明，壳聚糖作佐剂能显著增强血清抗体含量，并提高小鼠抗病毒攻击的能力。说明壳聚糖可以作为流感病毒灭活疫苗的新型佐剂，增强疫苗的抗体反应。流感病毒减毒活疫苗的免疫方式是经鼻腔免疫，目前尚没有发现壳聚糖作为流感病毒减毒活疫苗佐剂的相关研究。壳聚糖作为流感病毒减毒活疫苗中的佐剂与作为流感病毒灭活疫苗中的佐剂，两者作用机理不一样，所起的效果也不一样。与灭活疫苗相比，流感病毒减毒活疫苗最适pH值为4-5，需要调整壳聚糖溶液的相关条件比如浓度，使其能够保证疫苗的活性，细微条件的变化，可能就会导致活疫苗失活。壳聚糖作为佐剂应用于流感病毒减毒活疫苗能够提高粘膜抗体的产生
技术实现思路
本专利技术所要解决的第一个技术问题是，提供壳聚糖在制备流感病毒减毒活疫苗中的应用。本专利技术所要解决的第二个技术问题是，提供一种能够减少流感病毒减毒活疫苗的用量的佐剂。为了解决上述第一个技术问题，本专利技术提供了壳聚糖作为佐剂在制备流感病毒减毒活疫苗中的应用，所述流感病毒减毒活疫苗经鼻腔免疫。作为一个优选方案，壳聚糖溶液的pH值为4-5，壳聚糖溶液的浓度是O. 4g/100mL。为了解决上述第二个技术问题，本专利技术提供了一种能够减少流感病毒减毒活疫苗的用量的佐剂，所述流感病毒减毒活疫苗经鼻腔免疫，所述佐剂为壳聚糖。流感病毒减毒活疫苗是指哺乳动物包括人预防流感病毒感染的预防性疫苗，免疫方式是经鼻腔免疫，壳聚糖作为粘膜佐剂的添加可以减少流感病毒减毒活疫苗的用量。 主要包括以下步骤 O壳聚糖溶液的配制配制O. 4% (质量/体积)壳聚糖(sigama)溶液。2)流感病毒温度敏感株的制备及生物学特性研究从接种A/PuertoRico/8/34 (HlNl)病毒中抽提RNA，利用RT-PCR制备cDNA，扩增流感病毒的八个基因片段。利用重叠PCR的方法分别在PBl (K391E, E581G, A661T)和PB2 (N265S)上引入突变。麈A Phw2000质粒载体上，共同转染293T细胞。72小时后，收获样本，接种10日龄鸡胚，48-72小时后，收获鸡胚尿囊液，血凝实验和基因抽提、测序验证病毒序列的正确性。3)使用不同剂量的流感病毒温度敏感株在存在或不存在壳聚糖溶液作为佐剂时，研究其是否能够抵抗同源的HlNl和异亚型的H9N2病毒的攻击。本专利技术的优点在于，首次采用壳聚糖作为流感病毒减毒活疫苗佐剂，并通过大量创造性劳动得出壳聚糖在流感病毒减毒活疫苗中充分发挥作用，且疫苗活性不降低的应用条件。壳聚糖作为流感病毒减毒活疫苗佐剂能够增强疫苗的免疫原性，诱导机体更强的免疫应答，有效的减少疫苗的用量，在现有的生产能力和技术下，能够有效扩大免疫人群，在流感大流行时具有重要的社会意义和使用价值。附图说明图I为mPR8疫苗和PR8病毒的温度敏感性试验。图2为不同剂量的mPR8 (加或不加壳聚糖佐剂)免疫小鼠后使用ELISP0T检测脾细胞中INF-γ的分泌水平。图3为不同剂量的mPR8 (加或不加壳聚糖佐剂)免疫小鼠在IOOXLD5tl剂量的同源病毒PR8致死攻击后的存活率和体重变化。a: 10 TCID5tl (加或不加壳聚糖佐剂)减毒活疫苗免疫小鼠在IOOXLD5tl剂量的同源病毒PR8致死攻击后的存活率。b:10 TCID50 (加或不加壳聚糖佐剂)减毒活疫苗免疫小鼠在100 X LD50剂量的同源病毒PR8致死攻击后的体重变化。c :100 TCID50 (加或不加壳聚糖佐剂)减毒活疫苗免疫小鼠在100 X LD5tl剂量的同源病毒PR8致死攻击后的存活率。d:100 TCID5tl (加或不加壳聚糖佐剂)减毒活疫苗免疫小鼠在IOOXLD5tl剂量的同源病毒PR8致死攻击后的体重变化。e :1000 TCID50 (加或不加壳聚糖佐剂)减毒活疫苗免疫小鼠在IOOXLD5tl剂量的同源病毒PR8致死攻击后的体重变化。图4为100 TCID50 mPR8(加或不加壳聚糖佐剂)免疫小鼠在IOOXLD5tl剂量的异源病毒H9N2致死攻击后的存活率和体重变化。a: IOOTCId50 (加或不加壳聚糖佐剂)减毒活疫苗免疫小鼠在IOOXLD5tl剂量的异源病毒H9N2致死攻击后的存活率。b:100 TCID50 (力口或不加壳聚糖佐剂)减毒活疫苗免疫小鼠在IOOXLD5tl剂量的异源病毒H9N2致死攻击后的体重变化。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Samtoook等人，分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例I 一壳聚糖溶液的配制 称量3. 38g谷氨酸钠溶于IOOml水中配制成0. 2mol谷氨酸钠溶液。用乙酸调节溶液的pH值至2-本文档来自技高网...
【技术保护点】
壳聚糖作为佐剂在制备流感病毒减毒活疫苗中的应用，所述流感病毒减毒活疫苗经鼻腔免疫。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈则，
申请(专利权)人：上海生物制品研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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