用真菌过氧酶区域选择性羟化脂族烃类化合物制造技术

本发明专利技术涉及用于在取代或未取代的、直链或支化的脂族烃类化合物的2或3位进行羟化的酶方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用真菌过氧酶区域选择性羟化脂族烃类化合物涉及序列表本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过提述并入本文。专利技术背景
本专利技术涉及具有过氧酶(peroxygenase)活性的多肽用于脂族烃类化合物的位点特异性羟化的用途。背景发现来自伞菌类担子菌菌株Agrocybeaegerita(菌株TM-A1)、称为AaP的过氧酶氧化芳族醇和醛。AaP过氧酶从A.aegeritaTMA1通过数个步骤的离子层析和SDS-PAGE纯化，其分子量和N端14氨基酸序列在2D电泳之后确定，但并未分离编码的基因(Ullrich等,2004,Appl.Env.Microbiol.70(8):4575-4581)。WO2006/034702公开了使用AgrocybeaegeritaTMA1的AaP过氧酶对未活化的烃如萘、甲苯和环己烷进行酶羟化的方法。这亦描述于Ullrich和Hofrichter,2005,FEBSLetters579:6247-6250。WO2008/119780公开了来自Agrocybeaegerita、灰盖鬼伞(Coprinopsiscinerea)、Laccariabicolor和幅毛鬼伞(Coprinusradians)的八种不同的过氧酶，在本申请中亦示为SEQIDNO:1-8。DE10332065A1公开了通过使用AgrocybeaegeritaTMA1的AaP过氧酶从醇通过中间形成醛酶法制备酸的方法。报道了迅速和选择性分光光度法直接检测AaP过氧酶芳族羟化的方法(Kluge等,2007,ApplMicrobiolBiotechnol75:1473-1478)。公知将氧官能团直接区域选择性导入有机分子(加氧)在化学合成中构成问题。脂族糖的选择性羟化的催化是特别困难的。其产物可在广泛种类的不同合成中用作重要的中间物。具体而言，烷的化学强化相对复杂，需要强烈的/毒性化学品/催化剂，并导致一系列不希望的副产物。已知一种胞内酶，甲烷单加氧酶(MMO,EC14.13.25)，使一些烃化合物的末端碳氧合/羟化。所述MMO酶由数个蛋白质组分组成，并由甲基营养型细菌(例如荚膜甲基球菌(Methylococcuscapsulatus))形成；其需要复合的电子供体如NADH或NADPH，辅助蛋白(黄素还原酶，调节蛋白)和分子氧(O2)。MMO的天然底物是甲烷，其氧化为甲醇。作为特别非特异性的生物催化剂，除甲烷之外，MMO还氧合/羟化一系列其他底物如正烷烃及其衍生物，环烷烃，芳族化合物，一氧化碳和杂环化合物。该酶在生物技术中的应用目前尚不可能，因为其像大部分胞内酶一样，难于分离；其具有低稳定性；且其所需的共底物相对昂贵。
技术实现思路
在第一个方面，本专利技术的专利技术人提供了在取代或未取代的、直链或支化的脂族烃类化合物的任一末端的2或3位进行羟化的方法，所述脂族烃类化合物具有至少3个碳并具有在2或3位附接于碳的氢，所述方法包括将所述脂族烃类化合物与过氧化氢和具有过氧酶活性的多肽相接触，其中所述多肽包含：a)氨基酸序列，其与SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7或SEQIDNO:8具有至少50%同一性；和b)氨基酸序列，其由一种或多种下述基序所表示：基序I：[FL]XX[YF]S[AN]X[FHY]G[GN]GX[YF]N(SEQIDNO:9)；基序II：G[GN]GX[YF]NXX[VA]AX[EH][LF]R(SEQIDNO:10)；基序III：RXXRI[QE][DEQ]S[IM]ATN(SEQIDNO:11)；基序IV：S[IM]ATN[PG][EQN][FM][SDN][FL](SEQIDNO:12)；基序V：P[PDK][DG]F[HFW]R[AP](SEQIDNO:13)；基序VI：[TI]XXXLYPNP[TK][GV](SEQIDNO:14)。在一个实施方案中，所述脂族烃类化合物是脂肪酸。在另一个实施方案中，提供了在脂质的酰基的末端的2或3位进行羟化的方法，其包括将所述脂质与过氧化氢和具有过氧酶活性的多肽相接触，其中所述多肽包含：a)氨基酸序列，其与SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7或SEQIDNO:8具有至少50%同一性；和b)氨基酸序列，其由一种或多种下述基序所表示：基序I：[FL]XX[YF]S[AN]X[FHY]G[GN]GX[YF]N(SEQIDNO:9)；基序II：G[GN]GX[YF]NXX[VA]AX[EH][LF]R(SEQIDNO:10)；基序III：RXXRI[QE][DEQ]S[IM]ATN(SEQIDNO:11)；基序IV：S[IM]ATN[PG][EQN][FM][SDN][FL](SEQIDNO:12)；基序V：P[PDK][DG]F[HFW]R[AP](SEQIDNO:13)；基序VI：[TI]XXXLYPNP[TK][GV](SEQIDNO:14)。定义过氧酶活性：术语“过氧酶活性”在本文中定义为使用过氧化氢羟化萘的能力，亦称作“非特异性过氧酶”，EC1.11.2.1。其为血红素硫醇盐蛋白(heme-thiolateprotein)。该类型的酶包括由伞菌类担子菌分泌的糖蛋白。它们催化从H2O2将氧原子插入广泛种类的底物，包括芳环如萘、甲苯、菲、芘和对硝基苯酚，顽固的(recalcitrant)杂环化合物如吡啶、二苯并呋喃，多种醚(导致O-去烷基化)，和烷如丙烷、己烷和环己烷。其他可由过氧酶催化的反应包括羟化、环氧化、N-氧化、硫氧化(sulfooxidation)、O-和N-去烷基化、溴化和单电子氧化。它们对于氯几乎无或无活性。就本专利技术而言，过氧酶活性根据Kluge等(2007,ApplMicrobiolBiotechnol75:1473-1478)描述的分光光度方法确定。本专利技术的多肽具有SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7或8的成熟多肽的过氧酶活性的至少20%，优选至少40%，更优选至少50%，更优选至少60%，更优选至少70%，更优选至少80%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少100%。分离的多肽：术语“分离的多肽”用于本文指从来源分离的多肽。在一个优选的方面，所述多肽如通过SDS-PAGE确定，为至少1%纯，优选至少5%纯，更优选至少10%纯，更优选至少20%纯，更优选至少40%纯，更优选至少60%纯，甚至更优选至少80%纯，并且最优选至少90%纯。基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”在本文表示多肽制备物，其含有按重量计至多10%，优选至多8%，更优选至多6%，更优选至多5%，更优选至多4%，更优选至多3%，甚至更优选至多2%，最优选至多1%，并且甚至最优选至多0.5%的与其天然或重组结合的(associated)的其它多肽材料。因此，优选所述基本上纯的多肽是按存在于制备物中的全部多肽材料的重量计至少92%纯，优选至少94%纯，更优选至少95%纯，更优选至少96%纯，更优选至少96%纯，更优选至少97%纯，更优选至少98本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.03.28 EP 10158092.6;2010.03.28 EP 10158093.41.一种在取代或未取代的、直链烷的任一末端的2或3位进行羟化的方法，所述直链烷具有至少3个碳并具有在2或3位附接于碳的氢，所述方法包括将所述烷与过氧化氢和具有过氧酶活性的多肽相接触；其中所述多肽由...

【专利技术属性】
技术研发人员：M霍夫里克特，K希布纳，R乌尔里克，M基恩，S彼得，H伦德，L卡鲁姆，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：
国别省市：