金钯核壳材料构建肺癌肿瘤标志物免疫传感器制备及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种金钯核壳材料构建肺癌肿瘤标志物免疫传感器制备及应用，属于新型功能材料、生物传感与临床检验技术领域。本发明专利技术利用Au@Pd核壳纳米材料，具有比表面积大，生物相容性好，催化效率高等特点，显著提高了免疫传感器的灵敏度。该方法采用Au@Pd核壳纳米材料固载一抗和标记二抗，通过层层自组装构建一种肺癌肿瘤标志物电化学免疫传感器。本发明专利技术的金钯核壳材料构建肺癌肿瘤标志物免疫传感器优点在于灵敏度高、特异性好、易于操作，能实现血清样品中多种肺癌肿瘤标志物的灵敏、快速、准确检测，对肺癌的早期诊断具有重要的意义。?

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种金钯核壳材料构建肺癌肿瘤标志物免疫传感器制备及应用。具体是采用AuOPd核壳纳米材料构建的检测多种肺癌肿瘤标志物的标记型电化学免疫传感器，属于新型功能材料、生物传感与临床检验

技术介绍
癌症是严重威 胁人类健康的疾病之一，具有高发病率和高死亡率，若在癌症发展的早期阶段将其诊断出来，将显著提高病人的存活率。因此,早期肿瘤诊断已成为人们研究的热点问题参见(a) Rukan G.; DeirdreΜ. ; Alex F. ;MayreIi O. ; Ciara K. O’ Sullivan. Anal. Chem. , 2011, 83 (2)，563-570. (b) Zhong Z. Y. ; Peng N. ; Qing Y. ; Shan J. L. ; Li M. G. ; Guan ff. ; Dai N.;Gu X. Q. ; Wang D. Electrochimica Acta, 2011, 56, 5624-5629. (c) Zhang H. S. ; QiS. ff. Clinica Chimica Acta, 2011，412，1572-1577·。肿瘤标志物是在肿瘤发生和增殖过程中，机体内产生的某种特异性物质，通过这些特殊物质的存在或量变可以提示肿瘤的性质，借以了解肿瘤的组织发生、细胞分化、细胞功能，以帮助肿瘤的诊断、分类、预后判断以及治疗指导。目前临床研究较多，相对比较认同的肺癌相关肿瘤标志物有癌胚抗原(CEA)、鳞状细胞癌抗原(SCC)、细胞角蛋白19片断(Cyfra21-1)、组织多肽抗原(TPA)、糖类抗原(CA125)、糖类抗原(CA242)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)等七种肿瘤标志物。检测肿瘤标志物的方法主要有放射免疫测定法、酶免疫分析测定法、化学发光免疫分析等，这些检测方法具有如下特点 (I)放射免疫测定法该法在生物医学各个领域已得到广泛的应用，其具有操作简便、成本低等优点，但其放射性污染严重，灵敏度低，使其应用受到限制。(2)酶免疫分析测定法该法标记物制备简单，有效期长，对环境无污染等特点，得到了迅速地普及和发展，但因酶容易失活，导致其信号时间短，降低了方法的灵敏度和重现性。(3)化学发光免疫分析测定法该法具有灵敏度高、选择性强、重现性好、易于操作等优点，但其影响化学发光分析检测结果的因素较多，稳定性较差，且在发生化学反应之后，样品的发光无法再现。为解决上述方法存在的不足，本专利技术制备了一种无放射性污染、设备简单、操作方便、灵敏度高、重现性好、特异性强的电化学免疫传感器。近年来，纳米材料在单分子水平的各种探针技术、纳米集成阵列器件、电极表面修饰等方面的研究取得了突飞猛进的发展。AuiPd核壳纳米材料，具有大的比表面积，优越的电化学催化性能，以及良好的生物相容性等特性，可直接用于固载和标记生物分子。本专利技术采用AuOPd核壳纳米材料同时固载一抗和标记二抗,这样既保留了 Au、Pd两种贵金属纳米材料的性能优势，又简化了操作步骤，增强了传感器的稳定性，体现出优异的协同增敏效果；同时提高了电极表面的电子传递效率，降低了检测限，增加了电化学免疫传感器的检测灵敏度，制备了一种适用于检测多种肺癌肿瘤标志物的电化学免疫传感器。目前CN201110043433.I公开了一种非标记型电流型免疫传感器及其制备方法及应用，该传感器对癌胚抗原(CEA)的检测限达到3pg · mL—1，本专利技术CEA的检测限可以达到O.32pg · mL 1OCN03113053. 4公开了一种检测CA125无试剂安培免疫传感器，采用酶标记抗体。本专利技术制备了一种无酶肺癌肿瘤标志物免疫传感器，其制备过程简单、成本较低，对7种肺癌肿瘤标志物的检测限在O. 3(T0. 41pg · mL—1范围内，由此可见，灵敏度得到了显著提高，所制备的传感器能够快速、特异、灵敏地检测，有效克服了目前肿瘤标志物检测方 法的不足。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是避免传统检测方法的仪器设备复杂、操作过程繁琐、对检验人员的高技能要求及仅检测一种肺癌肿瘤标志物的缺点，提供一种低成本、高灵敏、特异性的肺癌肿瘤标志物电化学免疫传感器的制备方法，其制备技术成熟可靠。本专利技术的目的之二是提供所制备的肺癌肿瘤标志物电化学免疫传感器的应用，所述的电化学免疫传感器可以准确快速地检测出多种肺癌肿瘤标志物。本专利技术的技术方案如下 I.本专利技术的金钯核壳材料构建肺癌肿瘤标志物免疫传感器的制备方法，其特征是包括以下步骤 (1)AuiPd核壳纳米材料的制备； (2)AuiPd标记的二抗的制备； (3)肺癌肿瘤标志物电化学免疫传感器的制备。(I)中所述的AuOPd核壳纳米材料的制备,步骤如下 I)金纳米粒子胶体溶液的制备在三口烧瓶中加入O. 008 O. 012g HAuCl4 · 3H20，加入9(Tll0mL超纯水，磁力搅拌，沸腾时加入2. 5^3. 5mL的质量分数为1%的柠檬酸钠，持续搅拌，溶液变成酒红色，保持沸腾4(T50min，直至金纳米粒子胶体溶液的颜色不再变化，待反应完成后，冷却至室温。2)氯钯酸溶液的制备-M O. 0638g PdCl2，加入 O. 5 O. 7mL 的 I. 2mol Γ1 HCl，加超纯水稀释至3mL，超声至完全溶解。3)Au@Pd核壳纳米材料的制备取55 65mL金纳米粒子胶体溶液，置于4°C水浴中，搅拌加入I. (Γ2. OmL H2PdCl4溶液，然后缓慢加入14 18ιΛ IOmmol · L—1的抗坏血酸，搅拌，反应3(T40min,离心分离,去除上清液,洗漆4^5次,真空干燥,制得AuOPd核壳纳米材料。(2)中所述的AuOPd标记的二抗的制备，步骤如下 取浓度ImL IOPg ml/1的肺癌肿瘤标志物的二抗,加入I 3mg AuOPd,充分混合,4 震荡培养22 26h，然后，4°C冷冻离心，去除上清液，加入ImL pH=7. 0 7. 8的磷酸盐缓冲液，制得AuOPd标记的二抗，4°C储存备用。(3)中所述的肺癌肿瘤标志物电化学免疫传感器的制备，步骤如下1)将直径4mm的玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05Mm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净，使玻碳电极表面呈镜面； 2)将6 8PLAuiPd混合溶液滴涂到步骤I)处理后的玻碳电极表面，室温干燥； 3)在步骤2)修饰的工作电极表面滴涂5 7μ 10μδ · mL-1肺癌肿瘤标志物的一抗，4°C保存至干燥； 4)在步骤3)修饰的工作电极表面滴涂3 4μ IOOPg · mL—1牛血清白蛋白，4°C保存至干燥，超纯水清洗，晾干成膜，4°C储存； 5)在步骤4)处理后的工作电极表面滴涂5 7PL不同浓度的肺癌肿瘤标志物抗原，4°C保存至干燥； 6)在步骤5)修饰的工作电极表面滴涂5 7PLAuiPd标记的肺癌肿瘤标志物的二抗，4°C保存至干燥，制得肺癌肿瘤标志物电化学免疫传感器。2.本专利技术所述的制备的金钯核壳材料构建肺癌肿瘤标志物免疫传感器，用于肺癌肿瘤标志物的检测，其特征是包括以下步骤 (1)本专利技术将所述肺癌肿瘤标志物电化学免疫传感器作为工作电极，将参比电极一饱和甘汞本文档来自技高网...

【技术保护点】
金钯核壳材料构建肺癌肿瘤标志物免疫传感器的制备方法，其特征是包括以下步骤：（1）Au@Pd核壳纳米材料的制备；（2）Au@Pd标记的二抗的制备；（3）肺癌肿瘤标志物电化学免疫传感器的制备。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：魏琴，吴丹，郭爱平，张勇，李贺，杜斌，马洪敏，于海琴，庞雪辉，朱宝存，崔振涛，王志玲，闫良国，罗川南，孙蒙，范大伟，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
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