本发明专利技术公开了一种PCR-焦磷酸法检测金黄色葡萄球菌的检测引物、试剂盒和检测方法。本发明专利技术根据金黄色葡萄球菌血浆凝固酶DNA碱基列中的保守区域，用PyroMark?Assay?Design软件设计PCR引物和测序引物，建立了PCR-焦磷酸测序，从DNA碱基序列水平上检测金黄色葡萄球菌的方法。本发明专利技术先对目标片段进行PCR扩增，保证扩增片段的特异性，再用扩增产物制备单链模板，在测序引物的引导下进行焦磷酸测序。检测的所得碱基序列，用NCBI网站的BLAST功能反复比对时发现，血浆凝固酶DNA测序引物后的碱基序列具有良好的特异性，测序引物后29个DNA碱基序列为CAACCGACGACACCGAACCCTATTTTAGA时就可鉴定金黄色葡萄球菌。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程
，具体涉及PCR-焦磷酸法检测金黄色葡萄球菌的检测引物、试剂盒和检测方法。
技术介绍
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是引起医院感染和细菌性食物中毒的一种主要病原菌，该菌可分泌20多种毒性蛋白质，主要存在于皮肤、粘膜，特别是鼻咽部，30%-80%的人群为该病原菌的携带者，日本的调查结果表明，平均32. 5%的食品存在金葡菌的污染。随着分子生物学的发展，已有用普通PCR或荧光PCR检测金黄色葡萄球菌的报道，虽然这些方法可达到快速、高通量的目的，但却无法获得分子诊断的黄金标准-DNA碱基序 列，因此有出现假阳性的可能。焦磷酸测序(pyrosequencing)技术是近年来专利技术的一项实时地进行短片段DNA测序技术，该技术在DNA序列分析时不需要电泳和荧光标记，直接测定测序引物后面的碱基序列，通过提供可靠的序列信息来确认PCR产物，同时由于主要分析PCR产物双链中的一条链的序列，避免了由于DNA链的二级结构造成的人工假象，使测序结果更加准确，目前应用于基因表达、病毒检测、SNP分析、耐药基因检测、真菌鉴定、DNA甲基化分析等多个领域。致病性较强的金黄色葡萄球菌可产生凝固酶，使血浆中纤维蛋白原转变成纤维蛋白，附着于细菌表面成块，凝块包绕细菌，使其免遭抗生素、抗体、吞噬等多种因素的作用。葡萄球菌有2种凝固酶,一种是分泌至菌体外的蛋白质称为游离凝固酶(FreeCoagulase),此酶与血浆中的凝固酶反应因子协同作用于纤维蛋白原，使血浆凝固，故可用试管法检出，另一种结合于菌体表面并不释放，称为结合凝固酶(Bound Coagulase)或凝聚因子(ClumpingFactor),它可直接作用于纤维蛋白原,可用玻片法检出。凝固酶因子试验和血衆凝固酶试验是两个不相关试验，两者不能相互替代，也不可相互印证。金黄色葡萄球菌既可产生凝固酶，亦可产生凝集因子，而血浆凝固酶试验是鉴定金黄色葡萄球菌致病性的关键。我国国家标准GB4789. 10-2010《食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》，也将血浆凝固酶试验作为鉴定金黄色葡萄球菌的指标。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供简便、快捷、准确性高、特异性强的PCR-焦磷酸法检测金黄色葡萄球菌的检测引物、试剂盒和检测方法。本专利技术根据金黄色葡萄球菌的凝固酶基因保守序列设计扩增引物和测序引物，建立了结合PCR-焦磷酸测序从DNA碱基序列水平上检测金黄色葡萄球菌的方法，从而实现了本专利技术的目的。本专利技术的PCR-焦磷酸法检测金黄色葡萄球菌的检测引物，其特征在于，包括PCR引物和测序引物PCR 引物上游引物 F AGCCATTAGTTAAAATTCCACAGG ；(如 SEQ ID NO. I 所示)下游引物R TTTAGATGAGCTACCTTCAAGACC ；(如 SEQ ID NO. 2 所示)测序引物S CTTTAAGCGATAATTATACT (如 SEQ ID NO. 3 所示)。本专利技术的第二个目的是提供PCR-焦磷酸法检测金黄色葡萄球菌的检测试剂盒，包括DNA提取试剂，PCR反应试剂，单链模板制备试剂，焦磷酸测序试剂，PCR引物和测序引物，其特征在于，所述的PCR引物和测序引物为PCR 引物上游引物 F AGCCATTAGTTAAAATTCCACAGG ；(如 SEQ ID NO. I 所示)下游引物R TTTAGATGAGCTACCTTCAAGACC ；(如 SEQ ID NO. 2 所示) 测序引物S CTTTAAGCGATAATTATACT (如 SEQ ID NO. 3 所示)。本专利技术的第三个目的是提供非诊断目的的PCR-焦磷酸法检测金黄色葡萄球菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤(I)对样品进行增菌培养，提取增菌液中菌体的基因组DNA作为模板；(2 )使用上述PCR弓丨物进行PCR反应，回收PCR产物，制备单链模版，然后应用上述测序引物对PCR产物进行焦磷酸测序，自测序引物3\端后的第一个碱基开始测序，测序引物后的29个DNA碱基序列为CAACCGACGACACCGAACCCTATTTTAGA时，判断样品中含有金黄色葡萄球菌。优选，所述的PCR 反应，其扩增体系 50 μ L，PCR Mix Buffer25 μ 1，Taq 酶 5 μ 1，MgCl2 I μ 1,10 μ M上、下游引物各2 μ I,DNA模板I μ I,去离子水14 μ I,所述的PCR反应条件为预变性 95°C 5min ；95°C 15s，65。。30s, ,72°C 30s，45 个循环；72°C 12min。本专利技术根据金黄色葡萄球菌血浆凝固酶DNA碱基列中的保守区域，用PyroMarkAssay Design软件设计PCR引物和测序引物，建立了 PCR-焦磷酸测序，从DNA碱基序列水平上检测金黄色葡萄球菌的方法。本专利技术先对目标片段进行PCR扩增，保证扩增片段的特异性，再用扩增产物制备单链模板，在测序引物的引导下进行焦磷酸测序。检测的所得碱基序列，用NCBI网站的BLAST功能反复比对时发现，血衆凝固酶DNA测序引物后的喊基序列具有良好的特异性,测序引物后29个DNA碱基序列为CAACCGACGACACCGAACCCTATTTTAGA时就可鉴定金黄色葡萄球菌。PCR扩增试验结果，扩增引物具有较好的特异性，20株金黄色葡萄球菌均扩增出大小215bp大小的DNA片段,而单增李斯特氏菌等其他对照菌株未扩增出DNA条带。焦磷酸测序结果，20株金黄色葡萄球菌所得DNA碱基序列测序引物后的碱基序列比对，100%匹配的碱基数分别为29bp-44bp，均超过需检测的29个DNA碱基序列，而其他对单增李斯特氏菌等对照菌株未测出DNA碱基序列。模拟样品检测结果，焦磷酸测序结果与传统检测方法一致，但在检测周期上传统方法需要培养、划线分离、凝固酶试验等，需要2d-3d，而焦磷酸测序方法增菌18h-24h、核酸提取、PCR扩增和焦磷酸测序3h，整个试验21h-27h完成，简便快捷，而且可通DNA碱基序列的水平上检测金黄色葡萄球菌，避免了单纯PCR扩增检测易污染造成的假阳性结果，准确性高，具有较好的应用前景。附图说明图I是金黄色葡萄球菌血浆凝固酶(Co)基因的PCR扩增产物电泳图，其中M :50bpmarkerU BJ CMCC26003、2_20 :JP1_JP19、21 :去离子水；图2是金黄色葡萄球菌特异性试验PCR扩增产物电泳图，M:50bpmakerU:JPCMCC26003、2 :单增李斯特菌、3 :阪崎肠杆菌、4 :粪链球菌、5 :痢疾志贺氏菌、6 :小肠结肠炎耶尔森氏菌、7 :肺炎克雷伯氏菌、8 :藤黄微球菌、9 :大肠杆菌、10去离子水图3是BJ CMCC26003焦磷酸测序结果图；图4是JPl焦磷酸测序结果图；图5是JP2焦磷酸测序结果图；图6是JP3焦磷酸测序结果图；图7是JP4焦磷酸测序结果图；图8是JP5焦磷酸测序结果图 图9是JP6焦磷酸测序结果图；图10是JP7焦磷酸测序结果图；图11是JP8焦磷酸测序结果图；图12是JP9焦磷酸测序结果图；图13是JPlO焦磷酸测序结果图；图14是JPll焦磷酸测序结果图；图15是JP12焦本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种PCR？焦磷酸法检测金黄色葡萄球菌的检测引物，其特征在于，包括PCR引物和测序引物：PCR引物：上游引物F：AGCCATTAGTTAAAATTCCACAGG；下游引物R：TTTAGATGAGCTACCTTCAAGACC；测序引物S：CTTTAAGCGATAATTATACT。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：许龙岩，袁慕云，李宏，唐勤，相大鹏，
申请(专利权)人：许龙岩，袁慕云，李宏，唐勤，相大鹏，
类型：发明
国别省市：
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