本发明专利技术公开了用于检测丙型肝炎患者IL28BSNP12980275多态性的试剂盒，包括红细胞裂解液、DNA提取液、检测体系PCR反应液,其特征在于：检测体系PCR反应液包括dNTP，用于PCR反应的Tag酶及其缓冲反应液、检测IL28Brs12980275多态性用上下游引物，其中，IL28B上游引物序列：GTAGGGGGAATCATACAGCATT；IL28B下游引物序列：GAGAGTTCTGGAGATTGCTTGC。通过使用针对IL28BSNP位点rs12980275的特异性引物进行检测，具有很高的特异性及准确性；采用PCR方法扩增目的基因并测序检测其基因多态性，具有灵敏度高，操作简单、成本低等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属生命科学和生物
，特别是ー种临床检验用途的基因检测试剂盒，采用基因测序技术，对IL28B SNP rsl2980275多态性位点进行检测，可以用于预测丙型肝炎患者抗病毒治疗效果。
技术介绍
丙型肝炎是ー种由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)引起的肝脏急慢性炎症，自从1989年被美国发现以来，HCV感染逐渐成为ー个世界性公卫生问题。我国感染者约有4200万人，每年的新发病例约300-400万。80%感染者会发展成慢性肝炎，30%进展为终末期肝病，包括肝硬化、肝癌等。目前临床上主要是应用干扰素合用利巴韦林来进行丙肝 的治疗，但是这种联合治疗方案，不同的病人对这种联合治疗应答的效果差异很大。IL28B基因编码IFN- A 3，为III型干扰素，位于19号染色体上，包含6个外显子，属于IFN- A s家族。IFN- A主要是通过JAK-STAT信号途径，诱导STATl和STAT2的磷酸化，使ISGF3复合物产生，而且使2’，5’ -寡腺苷酸合成酶(2，, 5’ -oligoadenyIatesynthetase, 0AS)基因家族和MxA (也称Mxl)蛋白的表达明显提高，从而其抗病毒效应才发挥出来。2009年，美国杜克大学Goldstein等研究发现，编码IFN入3的IL28B基因附近有一些单核苷酸多态性(SNP)位点与HCV病毒自发清除能力及对干扰素的应答有夫。当这些等位基因发生突变后，患者的丙肝病毒自发清除和对干扰素应答能力发生明显变化。近期在欧洲人群和非洲人群之间进行的针对I型丙型肝炎基因组范围相关性研究中发现，其单核苷酸多态性(SNP)位点rs 12979860，rs 12980275，rs8099917等的变异与病毒的清除和干扰素治疗的应答高度相关，而位于IL28B基因下游3kb位置上的rsl2980275位点和治疗无应答(NVR)也密切相关。有报道指出IL28B SNP位点rsl2980275基因型为AA的患者的持续病毒学应答(sustained virological response, SVR)百分比明显高于GG基因型患者。通过研究rsl2980275位点的基因多态性，从而进一步完善临床对患者的丙肝病毒自发清除能力及丙型肝炎治疗效果的评估。目前可用SNP多态性检测的方法有限制性片段长度多态性(sscp)，基因测序，荧光定量PCR等，sscp技术相对简单，但酶切位点易受基因变异影响，影响结果判断。本专利技术考虑到节约成本及时间等因素，选用基因测序法检测IL28B基因多态性位点rsl2980275。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种用于检测丙型肝炎患者IL28B SNP12980275多态性的试剂盒，可用于检测rsl2980275位点是否发生突变。用于检测丙型肝炎患者IL28B SNP12980275多态性的试剂盒，包括红细胞裂解液、DNA提取液、检测体系PCR反应液，其特征在于检测体系PCR反应液包括dNTP，用于PCR反应的Tag酶及其缓冲反应液、检测IL28Brsl2980275多态性用上下游引物，其中，IL28B 上游引物序列GTAGGGGGAATCATACAGCAITIL28B 下游引物序列GAGAGITCTGGAGAITGCTTGC。进ー步地，所述试剂盒的使用方法包括如下步骤⑴采集待测血液样本，提取DNA ；(ii)以该DNA为模板，用IL28B上游引物和下游引物进行PCR扩增，得到PCR反应产物；( iii )对PCR反应产物测序，与IL28B正常基因序列进行比较，确定是否存在突变位点。 优选地，步骤(ii)的PCR反应按以下条件进行扩增94°C 5min;98°C 10s、58°C 20s,68°C 2min、40 个循环。本专利技术通过设计ー对与IL28B基因特异结合的引物，扩增片段包括SNP12980275序列。采用聚合酶链式反应(PCR)技木，对特定核苷酸片断进行指数扩增，并以扩增出的高浓度目的基因进行基因测序，检测IL28B SNP位点rsl2980275多态性，该位点的基因型有AA，AG及GG三种。本专利技术引物通过如下的方案进行设计使用Primer 6. Or软件协助设计引物，通过PCR扩增，将IL28B rsl2980275多态性位点位点完全扩增,然后进行直接测序,通过测序检测rsl2980275位点是否发生突变。IL28B 上游引物序列GTAGGGGGAATCATACAGCAITIL28B 下游引物序列GAGAGITCTGGAGAITGCTTGC用上述设计的引物对送检样本进行PCR扩增，并对PCR产物进行正反向测序反应扩增、纯化后变性、直接测序可以精确的检测IL28B SNP位点rs 12980275多态性。本专利技术的有益效果通过使用针对IL28B SNP位点rsl2980275的特异性引物进行检测，具有很高的特异性及准确性；采用PCR方法扩增目的基因并测序检测其基因多态性，具有灵敏度高，操作简单、成本低等优点。附图说明图I是IL28B基因扩增后，经I. 5%琼脂糖凝胶电泳后的电泳图。其中，从左至右泳道I为TAKARA2000的Marker，泳道2_3为受检样本。图2是样本I测序结果图。图3是样本2测序结果图。具体实施例方式下面结合具体实施例，进ー步阐述本专利技术。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。实施例I用于检测丙型肝炎患者IL28B SNP12980275多态性的试剂盒，包括(I)红细胞裂解液；(2) TIANGEN组织/血液/细胞基因组DNA抽提试剂盒；(3)检测体系PCR反应液，包括dNTP，用于PCR反应的Tag酶及其缓冲反应液、检测IL28B rsl2980275多态性用上下游引物，其中，IL28B 上游引物序列GTAGGGGGAATCATACAGCAITIL28B 下游引物序列GAGAGITCTGGAGAITGCTTGC。实施例2本专利技术试剂盒的使用方法I. I抽取300uL血液加入900uL红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混勻几次。IOOOOrpm离心I分钟(若离心机最高转速不允许,可3000rpm离心5min), 吸去上清，留下白细胞沉淀，加200uL缓冲液GA，振荡至彻底混匀。I. 2加入20 ill蛋白酶K溶液，混匀。I. 3加入200 U I缓冲液GB，充分颠倒混匀，70°C放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。I. 4加人200 ill无水こ醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。I. 5将上一歩所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，OOOrpm(13, 400Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。1.6向吸附柱CB3中加入500iU缓冲液⑶(使用前请先检查是否已加入无水こ醇)，12，000 rpm(13,400Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。I. 7向吸附柱CB3中加入700 ill漂洗液PW (使用前请先本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于检测丙型肝炎患者IL28B？SNP12980275多态性的试剂盒，包括红细胞裂解液、DNA提取液、检测体系PCR反应液,其特征在于：检测体系PCR反应液包括dNTP，用于PCR反应的Tag？酶及其缓冲反应液、检测IL28B？rs12980275多态性用上下游引物，其中，IL28B上游引物序列：GTAGGGGGAATCATACAGCATTIL28B？下游引物序列：GAGAGTTCTGGAGATTGCTTGC。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李文静，徐建成，王淑一，孙翠莲，
申请(专利权)人：吉林艾迪康医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：
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