本发明专利技术提供了一种含有启动子-多克隆位点-终止子序列的植物表达载体，通过PCR反应和限制性内切酶酶切、连接技术将CaMV?35S启动子，质粒载体的多克隆位点和NOS终止子依次克隆并插入到双元载体的多克隆位点，构建成植物表达载体。本发明专利技术提供的植物表达载体pCamE可以完整独立的驱动插入基因的表达，在该载体的多克隆位点、启动子上游和终止子下游分别提供了8个、4个和3个，共计15个限制性内切酶酶切位点，可方便使用。pCamE载体具有在大肠杆菌中拷贝数高，在植物宿主材料内能够稳定遗传、表达的特点，且在使用过程中方便、快捷、经济和实用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体的说，涉及一种植物表达载体及其在基因转化中的应用。
技术介绍
对于基因的研究和基因转化在生物领域的科研实验室内日趋常规化、普遍化，而在该研究过程中，转化载体的顺利构建是关乎实验成败的关键因素之一。一个基因的正常表达需要有一个完整的表达组件，其中包括启动子和终止子。在载体中往往需要有一个多克隆位点插入其中，以方便外源基因插入到表达载体中而完成一个目的基因的表达载体构建。其中启动子是驱动基因转录的一个重要元件，终止子是指导基因转录停止的元件。表达组件是一个表达载体必须具备的组件，在现有使用的植物表达载体的表达组件中往往有一个报告基因(如gfp、gus)的插入，且所能够提供的限制性内切酶位点很少。 目前构建目的基因的表达载体一般通过两个途径，I.在双元载体(如pBIN19 (GI: 1256363)、pGreen (GI: 4204727)、pEGFPl (GI: 1377908)、pPZP (GI: 506651)和pCAMBIA (GI: 7638064))等载体的多克隆位点插入目的基因，但这需要同时在目的基因上游插入启动子，下游插入终止子，因此，使得植物表达载体的构建过程步骤繁琐。2.在带有报告基因的表达载体(如pBI121 (GI: 19569229)、pEGAD (GI :7453571)、PCAMBIA1304 (GI: 7638083)和pBin_GFP)上插入目的基因，同时保留(或切除)报告基因(如PBI121载体的GUS基因、pEGAD载体的GFP基因)，但由于报告基因的融合及酶切位点的数量有限而使载体的使用具有一定的局限性。因此，迫切需要一种具有完整的表达组件，不含有报告基因、能够独立驱动插入基因的表达且含有丰富酶切位点的植物表达载体应用于基因转化研究工作中。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种含有完整表达组件的植物表达载体。本专利技术提供的含有启动子-多克隆位点-终止子序列的植物表达载体，是将启动子-多克隆位点-终止子序列插入双元载体的多克隆位点构建得到。其中，所述双元载体为pCAMBIA1300。其中，所述启动子为CaMV 35S启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。其中，所述终止子为NOS终止子，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。其中，所述多克隆位点为pUC19的多克隆位点，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所/Jn ο进一步地，本专利技术提供的植物表达载体为pCamE，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。pCamE植物表达载体的图谱如图I所示。本专利技术提供的植物表达载体为pCamE其多克隆位点、启动子上游和终止子下游分别有8个、4个和3个限制性内切酶酶切位点。本专利技术提供了含有所述植物表达载体的宿主细胞。本专利技术提供了上述植物表达载体在基因转化中的应用。本专利技术提供了上述植物表达载体在制备转基因植物中的应用。本专利技术还提供的了植物表达载体pCamE的构建方法，包括(I)克隆CaMV 35S启动子基因pro，用于扩增基因pro的引物为proF :5’-CAAGCTTAATTAAGAGCTCGCATGCCCTTTCAG-3' ；proR :5，-CGTCGACGACCGGTAGCGCTAGAGTCCCCG-3';将PCR扩增得到的目的基因pro与pGM-T载体连接，得到载体pGMpro ；(2)克隆NOS终止子基因Ter，用于扩增基因Ter的引物为TerF :5’ -CGGTACCGGGCCCTGATCTCGAGGAGCTAGCTCGAATTTCCCC-3' ；TerR :5’-CGAATTCGAATTAATTCCCGATCTAGTAACA TAGATG-3’ ；将PCR扩增得到的目的基因Ter与pGM_T载体连接，得到载体pGMTer ；(3)将载体pGMpro和载体pUC19的分别用HindIII和Sal I双酶切后进行连接，得到载体pUCpro(4)将载体pGMTer和载体pUCpro的质粒分别用Kpn I和EcoR I双酶切后进行连接，得到载体pUCpro-MCS-Ter;(5)将中间载体pUCpro-MCS-Ter和双元载体pCAMBIA1300的质粒分别用HindIII和EcoR I双酶切后进行连接，转化，培养，提取质粒，得到植物表达载体pCamE。其中，上述步骤(5)是将连接产物采用热击法转化大肠杆菌感受态细胞。挑取阳性克隆至3ml LB培养液中培养过夜，碱裂解法提取质粒提取溶于50 μ I TE缓冲液中，并酶切检测，获得植物表达载体PCamE。经计算可知植物表达载体pCamE在大肠杆菌DH5 α中的拷贝数为237。该载体拷贝数大于10，属于松弛型载体(拷贝数大于10 15个即为松弛型载体)，且该载体质粒大小为10131bp，小于15000bp，在大肠杆菌中比较容易分离纯化，为高拷贝质粒。本专利技术提供的植物表达载体pCamE具有完整的由启动子-多克隆位点_终止子序列构成的表达组件，它可以完整独立地驱动插入基因的表达。在该载体的多克隆位点、启动子上游和终止子下游分别提供了 8个、4个和3个，共计15个酶切位点，使用该载体时仅将外源基因直接插入该处提供的多克隆位点即可。本专利技术PCamE载体本身不含报告基因，能够很好地避免由于报告基因的融合，造成载体性能下降进而限制了载体的使用。将绿色荧光蛋白基因gfp插入该植物表达载体PCamE的Apa I限制性内切酶位点，构建了表达载体pCamGFP,并将pCamGFP分别转化了洋葱表皮细胞和拟南芥植株，结果显示pCamGFP载体所携带的绿色荧光蛋白基因gfp在植物材料中能够稳定遗传和正常表达，说明本专利技术中的植物表达载体pCamE可用于转化植物宿主材料,并与植物染色体整合后稳定表达。pCamE载体具有在大肠杆菌中拷贝数高，且在使用过程中具有方便、快捷、经济和实用的特点。附图说明图I为植物表达载体pCamE的图谱；粗体TATAA为真核启动子TATA框，粗体AATAAA为真核生物的加尾信号，框内TGA和TAG为翻译终止密码子。图2质粒pCamGFP在洋葱内表皮细胞中的表达；A图为可见光激发下质粒pCamGFP在洋葱内表皮细胞中的表达，B图为蓝光激发下质粒pCamGFP在洋葱内表皮细胞中的表达。图3质粒pCamGFP在转基因拟南芥中的表达；A图为可见光激发下质粒pCamGFP在拟南芥中的表达，B为蓝光激发下质粒pCamGFP在拟南芥中的表达。具体实施例方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的内切酶等酶试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司，引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成完成，测序工作由生工生物工程(上海)有限公司完成，其他生化试剂非特别注明外均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例I表达组建启动子-多克隆位点-终止子的构建( I)碱裂解法提取质粒挑取含有质粒pEGAD的大肠杆菌DH5 α菌株，接种于L 5ml LB液体培养基(I升培 养基中含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g, pH本文档来自技高网...
【技术保护点】
含有启动子？多克隆位点？终止子序列的植物表达载体，其特征在于，将启动子？多克隆位点？终止子序列插入双元载体的多克隆位点构建得到。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：马峙英，吴立柱，王省芬，李懿义，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：
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