本发明专利技术属于生物工程技术领域，提供了一种高活性壳聚糖酶的分离纯化工艺，所涉及的微生物菌株为一株蜡状芽孢杆菌Bacillus?cereus?JBSH-003,保藏号为CGMCC?No.6129。本发明专利技术以该菌株为出发菌株，经液体或固体发酵制备壳聚糖酶粗酶，在一定条件下分离、纯化制备高纯度、高活力的食品级壳聚糖酶。该酶可应用于水解壳聚糖制备医药级、食品级壳寡糖。纯化的壳聚糖酶制剂酶活达25000U/g以上。该制备工艺简单、条件易控制，酶活收率高，适合工业化生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程
，提供了一种高活性壳聚糖酶及其分离纯化工艺。
技术介绍
甲壳素有“人体生命第六大要素”之 美誉，是地球上仅次于纤维素的第二大天然类高分子化合物。壳聚糖是几丁质脱乙酰后的产物，含有游离氨基，是天然多糖中唯一的碱性多糖，但由于壳聚糖水溶性差，难以发挥其应有的生物学活性，大大限制了壳聚糖的应用范围。近年来发现壳聚糖降解产物壳寡糖具有独特的生理功能，生物学活性是相等质量壳聚糖的10倍，因此，有关壳寡糖的研究已经受到各国政府和科研人员的高度重视。我国这方面的研究虽然起步较晚，但经过十几年的努力，在壳寡糖的制备和应用领域取得了丰硕的成果。传统化学方法生产壳寡糖存在环境污染等重大问题，而且反应条件不易控制，产品质量难以保证。生物酶法制备壳寡糖具有反应条件温和、整个降解过程中无其他反应试剂加入、不至于发生其它副反应、降解过程及降解产物相对分子质量分布易于控制、壳寡糖得率高、不造成环境污染等优点，代表了壳寡糖制备工艺的发展方向。壳聚糖酶广泛分布于细菌、真菌、病毒以及植物等生物群中。国外对壳聚糖酶产生菌的许多菌株做了较多研究，报道较多的主要是酶的纯化、作用机理和理化性质方面。Isabelle Boucher等对链霉菌属菌株产壳聚糖酶进行了分离纯化和特性研究，所得纯化酶分子量为29. 5kDa，该酶最适温度为65°C，最适pH值为5. 5,能降解脱乙酰度在44% 99%的壳聚糖,但不能降解几丁质和纤维素。国内关于微生物壳聚糖酶的研究仍较少。孙金凤等从自然界中筛选到I株芽孢杆菌产酶活力为O. 59U/mL，经硫酸二乙酯(DES)诱变处理后，得到I突变菌株，产酶活力达到I. 60U/mL。孙玉英等报道了从土壤中分离得到的I株壳聚糖酶高产菌株，是目前国内报道中产酶量最多的菌株，经鉴定该酶属微杆菌Microbacterium,酶活力达到118U/mL,培养基初始pH值为6.3，培养温度为30°C，培养时间为96h。总之，经过国内外学者不断努力，近年来发现了许多产壳聚糖酶微生物菌株，也对一些重要的产壳聚糖酶菌株进行了深入研究，但总体来说，酶活力还普遍较低，产酶周期长，很难实现商品化，真正产酶量大、适用于工业化大规模生产的菌株尚未见报道。利用生物学方法和基因工程技术，筛选出产酶活性高、易于培养的壳聚糖酶工业菌种是解决制约生物酶法制备壳寡糖的关键所在。
技术实现思路
本专利技术针对上述技术存在的不足，提供一种高活性壳聚糖酶的分离纯化工艺，所涉及的微生物菌株为一株蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus JBSH-003，保藏号为CGMCCNo. 6129。本专利技术以该菌株为出发菌株，经液体发酵制备种子液，再经液体发酵或固体发酵方法制备壳聚糖酶粗酶，在一定条件下分离、纯化制备纯度较高的高活力、食品级壳聚糖酶。该酶可应用于水解壳聚糖制备医药级、食品级壳寡糖。纯化的壳聚糖酶制剂酶活达25000U/g以上。该制备工艺简单、条件易控制，酶活收率高，适合工业化生产。本专利技术提供的具体技术方案是首先获得了一株新的菌株，该菌株分离自黄河三角洲地区的腐败落叶和浅表层土壤中，经UV和化学诱变剂的反复诱变处理筛选而来，为一株壳聚糖酶高产菌株。专利技术人最终确定该菌种为腊状芽胞菌株，Bacillus cereus,并对其进行了生物保藏,其保藏号为CGMCC No. 6129。并通过该菌株进行发酵后获得了壳聚糖酶。经研究发现，该菌株所产壳聚糖酶对酸碱度适应范围较广，在pH值为4. 5-6. 5均表现很高的酶学活性；且该菌株所产酶在40°C _65°C温度范围内均具有较高的生物学活性；该菌株深层液体发酵粗酶活性为227U/mL，固体发酵粗酶活性高达2732U/g，固体发酵比深层液体发酵产酶水平高10倍以上。在培养基中有无壳聚糖均对其产酶能力不会产生太大的影响，证明该菌株具有非诱导产酶活性。采用该菌株制备高活性壳聚糖酶精酶的制备方案如下·(I)菌种发酵产酶菌种活化后，经液体发酵扩繁种子液，再利用发酵方法生产得到壳聚糖酶粗酶液；其中所述的发酵方法为液体发酵或固体发酵；所述的粗酶液为液体发酵的发酵液，或固体发酵后的鲜料或干燥粉碎后的干料，用缓冲液抽提出的酶液；(2)壳聚糖酶纯化步骤(I)获得的粗酶液，经离心除杂、微滤除菌、超滤膜超滤浓缩得酶浓缩液，将所得到的浓缩液用乙醇醇沉，收集沉淀，得湿固酶；(3)干燥对湿固酶进行低温真空干燥，即得高活性壳聚糖精酶；具体的方法如下I.菌种发酵产酶(I)菌种活化将低温保存的CGMCC No. 6129试管斜面菌种转移到室温条件下，对菌种活化4-8h ；(2)液体菌种扩繁取活化的试管菌种，在无菌操作台上，用IOmL灭菌蒸馏水将试管斜面表面的菌落冲洗入装有灭菌培养基的三角瓶中，每只试管接种I个三角瓶；33 35°C下振荡培养12-18h，转速50-300r/min得到液体菌种即种子液；(3)固体发酵产酶将步骤(2)制备的液体菌种，按O. 5-10% (v/w)的接种量接入固体发酵的培养基中，培养温度为25 39°C，发酵时间40 100h，中间每隔15小时翻曲一次；固体发酵培养基原料为廉价易得的农作物副产品，具体按重量份计为65 80份麸皮，10 20份豆柏，8 15份玉米粉，I 3份硫酸铵，固体物料与水的重量比为I: I. 05 1.5 ;初始pH值自然；(4)干燥粉碎固体发酵培养结束后，对发酵湿固料进行低温真空干燥，温度不高于50°C，粉碎过80目筛后，得到高活性固体壳聚糖酶粗酶产品。2.壳聚糖酶粗酶液的制取制取壳聚糖酶粗酶液的原料为干燥粉碎后的固体壳聚糖酶产品或直接用固体发酵完成后不经干燥的鲜料，用pH=4. O的含10-30%(w/w)硫酸铵酸性缓冲液或NaAC-HAC缓冲液或磷酸盐缓冲液在常温下进行提取，料液比1:10-40( 八)(折合成干品计)，时间lh-3h，过滤、离心或压滤去除固体残渣，收集滤液，即为壳聚糖酶的粗酶液。壳聚糖酶的粗酶液生产还可用菌株直接采用液体三级发酵的方式获得。首先采用液体发酵的方法对活化的CGMCC No. 6129试管斜面菌种进行扩繁，并以此为菌种再进行二级、三级液体发酵，逐级放大，放大比例为1:10 ;对三级发酵罐中的发酵液经高速离心去除固体残渣后即为壳聚糖酶的粗酶液。经检测菌株CGMCC No. 6129深层液体发酵粗酶活性为227U/mL，所述三级发酵的方式均采用现有的技术完成。3.壳聚糖酶的纯化(I)对液体发酵获得的发酵液或固体发酵提取获得的壳聚糖酶粗酶液经离心除杂，再进行微滤，进一步去除菌体和微小颗粒杂质，微滤液再经6000Dalton的超滤膜组件超滤浓缩，浓缩倍率为1/5-1/10，收集超滤内液；(2)用95%的乙醇常温下进行醇沉，乙醇和超滤内液的体积比为2-3:1，过滤、离心或压滤，收集沉淀。 4.干燥经步骤3沉淀析出的湿固酶在50°C条件下真空干燥，即为纯度较高的精酶。提取过程中，利用乙酰丙酮法对每个步骤所得产物进行酶活测定，以固体壳聚糖酶粗酶的总活力为100%计算，每步操作完成后分别取样检测酶活，计算出每步操作后酶活力的回收率。结果显示整个工艺过程酶活的综合回收率为35%以上，所制得的精酶活性可以达到25000U/g以上。本专利技术采用了自主筛选的高活性壳聚糖本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高活性壳聚糖酶，其特征在于：是由保藏号为CGMCC？No.6129的菌株发酵获得的。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：徐泽平，马韵升，史庆苓，张心青，王秀芝，虞凤慧，高洪奎，
申请(专利权)人：黄河三角洲京博化工研究院有限公司，山东京博控股股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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