本发明专利技术涉及一种新型β-葡萄糖苷酶及其编码基因和应用。本发明专利技术还涉及含有所述编码基因的表达载体和宿主细胞。本发明专利技术还涉及利用所述β-葡萄糖苷酶将底物水解为简单糖的方法。本发明专利技术的β-葡萄糖苷酶具有常温活性最高及中性及弱碱性条件下稳定性好的特点，可良好地应用于工业生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及一种新型β-葡萄糖苷酶及其编码基因和应用。
技术介绍
纤维素是多个葡萄糖残基以β_1，4-糖苷链连接而成的多聚物，是地球上最丰富的可再生的生物质资源。以木质纤维素为原料、用纤维素酶水解纤维素生成葡萄糖，进而发酵为燃料乙醇成为应对当今世界能源危机、环境污染等问题的重要出路。纤维素酶是能够将纤维素转化成葡萄糖的一系列酶的总称，主要包括内切葡聚糖酶(endo-β -1,4-glucanase,EC 3. 2. I. 4)、外切葡聚糖酶(exoglucanase,EC3. 2. I. 91)和β-葡萄糖苷酶(i3-gluc0SidaSe，EC 3.2.1.21)。内切葡聚糖酶作用于纤维素长链分子的内部将长纤维切成短纤维，外切葡聚糖酶作用于纤维素分子的一端，以两个葡萄糖残基为 单位进行切割生成纤维二糖，β-葡萄糖苷酶切割纤维二糖及一些纤维寡糖最终生成单个的葡萄糖分子。作为纤维素复合酶系的重要组成之一，β -葡萄糖苷酶的关键作用主要体现在两个方面一方面，由于纤维二糖积累对其上游内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的活性具有显著的反馈抑制作用，因此，β-葡萄糖苷酶的高效水解对纤维素的彻底降解起到至关重要的作用。另一方面，除水解活性，β_葡萄糖苷酶还具有转糖苷活性，在一定的条件下可以通过转糖苷作用将两个葡萄糖分子合成一个槐糖分子。而已经发现槐糖是纤维素酶基因表达的强诱导物。一般认为丝状真菌中纤维素酶合成的诱导机制是存在于分生孢子和菌丝表面的少量组成型纤维素酶首先降解纤维素生成纤维二糖等寡糖，然后在质膜结合的葡萄糖苷酶的转糖苷作用下，生成槐糖等诱导物，经细胞膜上的组成型透性酶系统进人细胞内，启动纤维素酶的合成。由此可见，提高β_葡萄糖苷酶在纤维素降解体系的催化活性，对于提高纤维素降解体系转化效率及降低纤维素乙醇产业生产成本，具有巨大的商业价值和现实意义。β -葡萄糖苷酶底物专一性差异很大，除了作用于纤维二糖及纤维糊精而在纤维素乙醇产业发挥重要作用外，还可作用于芳基葡萄糖苷(如熊果甙、水杨苷及生色化合物P-硝基苯基-β -D-吡喃葡萄糖苷)；烷基葡萄糖苷(甲基-β -D-葡萄糖苷)；β -I，3-葡萄糖苷(昆布二糖)等。因此在其他领域的应用也非常广泛。例如在食品行业中，由于它能将水果中糖苷酶前体的芳香族化合物释放变为具有浓郁香味的化合物，从而改善茶叶、果汁和果酒的风味，因此其作为特殊的风味酶已得到广泛应用；在医药保健品行业中，β_葡萄糖苷酶可通过生物转化功能，将某些广泛存在的天然产物转化为在自然界稀有甚至不存在的物质。例如，β_葡萄糖苷酶可将无活性的结合型大豆异黄酮转化为具有生理活性的游离型苷元，进而发挥改善更年期综合症、预防骨质疏松、抗氧化等生物学功能等。葡萄糖苷酶广泛存在于自然界中许多植物和微生物体内。由于植物来源的 葡萄糖苷酶活性远比微生物来源要低，所以其分离主要集中在微生物上。起初人们主要从纯培养微生物中分离，如木霉、青霉、黑曲霉等。随着元基因组学技术的兴起，人们意识到占自然界中微生物种类99%以上的微生物实际上未可培养，而其中必然蕴藏着丰富的基因资源，所以越来越多的研究者开始将目光集中到纤维素被活跃降解的各种环境系统上，通过构建和筛选各种环境样品的未培养微生物宏基因组文库获得具有不同优良生化性质的β -葡萄糖苷酶新基因，如Walter等人构建鼠大肠未培养微生物的BAC基因文库，并克隆到一个 β -葡萄糖苷酶基因(Walter 等，Appl Environ Microbiol, 71 :2347-2354,2005)；Ferrer等人构建了奶牛的瘤胃内容物的宏基因组文库，从中克隆到包括9个内切葡聚糖酶基因和 I 个 β-葡萄糖苷酶基因(Ferrer M等,Environ Microbiol, 7 :1996-2010, 2005.)；Feng等人报道从兔子盲肠未培养微生物中克隆和鉴定了 4个内切葡聚糖酶和7个β -葡萄糖苷酶基因 C(Feng Y 等,Appl Microbiol Biotechnol, 75 :319-328, 2007);唐咸来等人从沼气池宏基因组文库中克隆和鉴定了一个β-葡萄糖苷酶基因等。针对不同工业用途需要使用不同性质的葡萄糖苷酶，而现有技术中的大部分，尤其是细菌来源的β_葡萄糖苷酶的活力较低，在产量、理化特性、催化效率等方面也远远不能满足现代工业生产的需求，因而有必要进一步扩大筛选对象，从中筛选出酶活较高、理化特性更趋多样化的新的β_葡萄糖苷酶。白蚁作为自然界生态系统中木质纤维素的重要降解者，其独特的肠道共生微生物基因组中必然蕴藏着丰富的纤维素酶基因资源和 代谢途径。但至今尚且没有从白蚁肠道细菌中克隆到相关葡萄糖苷酶基因的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新功能基因的克隆方法。本专利技术的目的在于提供一种新型葡萄糖苷酶(Bgl7016)及其编码基因(bgl7016)和应用。本专利技术的目的在于提供包括β-葡萄糖苷酶基因的表达载体和宿主细胞，基因的表达和蛋白纯化方法，以及重组蛋白的酶学特性和功能特征。在本专利技术的第一方面，提供一种分离的多肽，该多肽选自下组(a)如SEQ ID NO 2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO 2氨基酸序列经过一个或多个(如1_20个，较佳地1_10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；(c)具有(a)多肽功能的SEQ ID NO 2的蛋白片段(较佳地，其与SEQ ID NO 2的序列相同性高于70% ;更佳地高于75% ;更佳地高于80% ;更佳地高于85% ;更佳地高于90% ;更佳地高于95% ;更佳地高于98%或99% )。在一个优选例中，所述的多肽来源于白蚁肠道元基因组。在另一优选例中，所述的多核苷酸它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组(I)编码所述多肽的多核苷酸；(2)与多核苷酸(I)互补的多核苷酸。在另一优选例中，该多核苷酸编码如SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的多肽。在另一优选例中，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示，或如SEQ ID NOI中第77-所示。在本专利技术的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。在本专利技术的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或其基因组中整合有所述的多核苷酸。在本专利技术的另一方面，提供一种所述的多肽的制备方法，该方法包含(a)培养所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出所述的多肽。在本专利技术的另一方面，提供所述的多肽的用途，用于形成简单糖(如葡萄糖)。在另一优选例中，所述的多肽用于水解糖苷键。 在另一优选例中，所述的多肽水解选自(但不限于)下述底物的糖苷键纤维二糖、芳基葡萄糖苷或烷基葡萄糖苷。在另一优选例中，所述的底物选自(但不限于)水杨苷、对硝基苯-D-葡萄糖苷或对硝基苯纤维二糖苷。在本专利技术的另一方面，提供所述的多肽的用途，用于作为以纤维素为原料的乙醇发酵的添加物；作为食品工业中调节风味的添加物；作为医药保健品的添加物(例如将无活性的结合型大豆异黄酮转化为具有生理活性的游离型苷元)。在本专利技术的另一方面，提供一种组合物，它含有安全有效量的所述的多肽以及食品学本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离的多肽，其特征在于，该多肽选自下组：(a)如SEQ？ID？NO：2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ？ID？NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；(c)具有(a)多肽功能的SEQ？ID？NO：2的蛋白片段。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄勇平，刘宁，严兴，苗雪霞，王倩，谢磊，周志华，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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