c-Jun的截短型维持胚胎干细胞多能性的方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及AP-1家族蛋白c-Jun的截短型在维持胚胎干细胞多能性的方法和应用。本发明专利技术的目的是提供一种使用c-Jun的截短型维持胚胎干细胞多能性的方法和应用，可以不依赖于LIF而维持胚胎干细胞的多能性和自我更新，所述c-Jun的截短型为AP-1家族蛋白c-Jun的C端缺失和N端缺失。本发明专利技术涉及培养ES细胞的方法，所述方法涉及在无饲养层细胞和LIF的条件下培养胚胎干细胞，提供了胚胎干细胞在再生医学中实际应用的新途径。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及AP-I家族蛋白C-Jun的截短型维持胚胎干细胞多能性的方法和应用。
技术介绍
AP-I家族是一类细胞响应外界信号包括生长因子、细胞因子和胞外压力的转录激活蛋白。结构上由不同的亚基组成同源或异源二聚体。这些亚基包括Jun、Fos和ATF。每个亚基上均有一个亮氨酸拉链结构，两两形成与DNA结合的锌指模块。ES细胞及胚胎干细胞是一中在囊胚的内细胞团中分离出的具有体外无限增殖、自我更新和多向分化的特性的细胞。无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为机 体几乎所有的细胞类型。鉴于ES细胞的体外无限增殖和多分化潜能，其在再生医学领域具有广阔的应用前景。胚胎干细胞的自我更新和多能性的维持受到一系列核因子和胞外信号分子的调控。在体外培养条件下，干细胞的很难维持其多能性状态，而倾向于自发地分化(即，获得特化的结构或功能)。干细胞分化是由于许多因素，包括生长因子、细胞外基质的分子和成分、环境应激源等造成。胚胎干细胞的体外增殖和多能性的维持依赖于饲养层细胞和白血病抑制因子(LIF)的加入。在无饲养层细胞或LIF的状态下，胚胎干细胞在血清中培养将会逐步走向分化。胚胎干细胞的体外增殖和自我更新机制一直是干细胞生物学研究的热点，其具体的分子生物学机制有待进一步的阐明。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种使用c-Jun的截短型维持胚胎干细胞多能性的方法和应用，可不依赖于LIF而维持胚胎干细胞的多能性和自我更新。本专利技术的技术方案为提供一种c-Jun的截短型维持胚胎干细胞多能性的应用，所述c-Jun的截短型为AP-I家族蛋白c-Jun的C端缺失和N端缺失,所述c-Jun的C端缺失为AP-I家族蛋白c-Jun的第I位氨基酸到256位氨基酸的截短或其对应的核酸序列，所述c-Jun的N端缺失为AP-I家族蛋白c-Jun的170位氨基酸到末端334位氨基酸的截短或其对应的核酸序列。优选的，上述c-Jun的截短型维持胚胎干细胞多能性的应用中，所述胚胎干细胞为小鼠胚胎干细胞。本专利技术的另一技术方案为提供一种使用c-Jun的截短型维持胚胎干细胞多能性的方法，a、将含有供体c-Jun蛋白氨基酸序列的170位氨基酸到334位氨基酸或第I位氨基酸到256位氨基酸对应的核酸序列克隆到表达载体上，并注入胚胎干细胞；b、将步骤a所得胚胎干细胞在无LIF的胚胎干细胞培养基中培养。优选的，上述使用c-Jun的截短型维持胚胎干细胞多能性的方法中所述胚胎干细胞为小鼠胚胎干细胞。优选的，上述使用C-Jun的截短型维持胚胎干细胞多能性的方法中所述胚胎干细胞培养基为含血清的小鼠mES培养基。优选的，上述使用C-Jun的截短型维持胚胎干细胞多能性的方法中所述胚胎干细胞培养基为不含血清的小鼠mKSR培养基。本专利技术涉及培养ES细胞的方法，所述方法涉及在无饲养层细胞和LIF的条件下培养胚胎干细胞，提供了胚胎干细胞在再生医学中实际应用的新途径。c-Jun截短型对胚胎干细胞的维持的意义主要是可以在体外无饲养层细胞和LIF的条件下维持干细胞的多能性，有利于胚胎干细胞的体外培养。另外一个更加重要的意义在于胚胎干细胞多能性维持机制上的解释。AP-I家族蛋白与胚胎干细胞的关系，之前还没有发现过，对了解干细胞多能性的维持具有十分重要的意义。附图说明 图I是小鼠c-Jun蛋白全长和不同截短型的结构图。根据NCBI上小鼠c-Jun的蛋白序列全长和结构域信息，设计不同的引物，采用常规分子克隆的方法，克隆出图示中不同氨基酸的序列的多妝片段用于实验。其中1-334多妝片段命名为c-Jun-FL ； 1-256多妝片段命名为c-Jun(-bZIP)，170-334片段命名为c-Jun_DN。将克隆的片段用合适的限制性内切酶克隆到逆转录病毒载体PMXS上，进行目的片段的表达；图2是在OKS三因子重编程模型下，c-Jun蛋白全长或不同截短型与空载相比的重编程效率比较图。以OKS和空载病毒感染0G2胚胎成纤维细胞为对照，分别用OKS及所示c-Jun基因全长或不同截短型病毒感染0G2胚胎成纤维细胞。感染后在含血清的mES培养基中进行诱导培养，在合适的天数在荧光显微镜下计算GFP阳性的荧光克隆数。将各片段得到的重编程克隆数除以空载状态下的重编程克隆数，得到全长或各截短片段对重编程效率的影响；图3是胚胎干细胞和胚胎成纤维细胞中c-Jun表达含量比较图。采用常规分子生物学方法分别提取胚胎干细胞和胚胎成纤维细胞的总RNA，将2ug总RNA反转为cDNA后采用荧光定量PCR进行检测。比较胚胎干细胞和胚胎成纤维细胞中c-jun基因的表达量；图4是胚胎干细胞向拟胚体分化过程中c-jun表达量变化图。将胚胎干细胞按照常规方法向拟胚体进行分化，分别收取不同天数的分化培养物提取总RNAJf 2ug总RNA反转为cDNA后采用荧光定量PCR进行检测。比较向拟胚体分化不同天数过程中c-jun基因的表达量变化；图5是胚胎干细胞在分化过程中c-jun表达量变化图。将胚胎干细胞在撤去白细胞抑制因子(LIF)的条件下培养，细胞将逐步分化。收取不同天数的培养物提取总RNAJf2ug总RNA反转为cDNA后采用荧光定量PCR进行检测。比较分化不同天数过程中c-jun基因的表达量变化；图6是c-Jun、c-Jun(-bZIP)和C-JunDN对干细胞分化影响效果图。分别构建c-Jun.c-Jun(-bZIP)和C-JunDN稳定表达干细胞株，并在胚胎干细胞的培养条件下进行连续传代培养。观察干细胞增殖和分化状态。图中可见c-Jun全长(C-JunFL)可引起胚胎干细胞分化；图7是c-Jun (-bZIP)和C-JunDN对干细胞多能性维持效果图。分别构建c-Jun (-bZIP)和c-JunDN的稳定表达干细胞株，在撤去LIF后的胚胎干细胞培养基中培养。观察观察干细胞的多能性状态，并用AP染色检测多能性分子标记物碱性磷酸酶的活性。c-Jun (-bZIP)和C-JunDN的过表达均会在没有LIF的状态下维持干细胞的多能性，延迟分化。图中黑色为碱性磷酸酶染色。具体实施例方式为详细说明本专利技术的
技术实现思路
、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。除非另外指明，本专利技术的实践将使用分子生物学、微生物学、细胞生物学、免疫学和重组DNA的传统技术，其属于本领域技术范围。参见例如分子克隆实验指南，第3版(2002)，Sambrook, Fritsch 和 Maniatis 等人编著！CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBI0L0GY(F.M. Ausubel 等人编著(1987));丛书 METHODS IN ENZYM0L0GY(Academic Press,Inc.) PCR 2 A PRACTICAL APPROACH (1995)，M. J. MacPherson，B. D. Hames 和 G. R. Taylor等人编著，ANTIBODIES(1988) ,Harlow和Lane等人编著，A LABORATORY MANUAL and ANIMAL CELL CULTURE (1987)，R. I. Freshney 等人编著；HANDBOOK OF STEM本文档来自技高网...

【技术保护点】
c？Jun的截短型维持胚胎干细胞多能性的应用，所述c？Jun的截短型为AP？1家族蛋白c？Jun的C端缺失和N端缺失，所述c？Jun的C端缺失为AP？1家族蛋白c？Jun的第1位氨基酸到256位氨基酸的截短或其对应的核酸序列，所述c？Jun的N端缺失为AP？1家族蛋白c？Jun的170位氨基酸到末端334位氨基酸的截短或其对应的核酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：裴端卿，刘晶，韩庆凯，陈捷凯，韦备，彭梅秀，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：