一种肿瘤抗原特异性T细胞的获取方法技术

本发明专利技术提供了一种肿瘤抗原特异性T细胞的获取方法，包括产生和扩增方法，所述产生方法是将含有抗原提呈细胞（APC）的第一群细胞与包被有抗原的界面接触，让APC摄取包被在界面上的抗原；再将含有T细胞的第二群细胞与摄取了抗原的第一群细胞共培养，产生抗原特异性T细胞。一种能产生大量反应性极高的抗原特异性T细胞的方法，获得的T细胞无论是细胞表面受体表达还是细胞因子的分泌都是现有其它培养系统无法比拟的。用此方法无需知道特殊抗原（当然已知的抗原也可以应用），经1-2次扩增就能达到治疗量，包含CD4和CD8系列的抗原特异性T细胞，而且可以根据需要分选CD4或CD8细胞。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及特异性T细胞的产生和扩增方法，特别涉及肿瘤抗原特异性T细胞的生产和扩增方法。
技术介绍
体外生成和扩增具有辨认各种抗原能力的T细胞已成功地用于治疗恶性肿瘤和病毒感染性疾病。这种特异性过继免疫治疗策略的诱人之处在于它能诱导只针对疾病细胞的特异性免疫效应，而不伤及正常细胞，无副作用。因此，常规、可重复的体外扩增抗原特异性T细胞的方法是实现肿瘤过继免疫治疗的关键。如今，体外培养产生有肿瘤治疗效果的抗原特异性T细胞技术还远未成熟，需要进一步完善，在提高其抗肿瘤功能的同时简化抗原特异性T细胞的产出程序，使其得到广泛应用。目前扩增T细胞的方法主要依靠人类白细胞相容抗原(MHC)配对的抗原提呈细胞 (APC)和外源性生长因子，如白介素2 (IL-2)联合⑶3抗体用于刺激T细胞分裂，扩增的T细胞主要是CD8阳性T细胞亚群。然而，由于APC存活期相当短，长期培养T细胞时要不断收集和补充死亡的APC。当疾病影响到免疫系统，如免疫缺陷，病毒感染等，APC的来源更是无法解决。另外，获得临床治疗量的抗原特异性T细胞往往需要在培养过程中多次活化和扩增，需投入大量人力，既耗时，成本又高，且重复性差，又难标准化。因此，改进抗原特异性T细胞克隆的扩增方法是非常必要的。在改善抗原特异性T细胞的抗肿瘤功能的同时简化抗原特异性T细胞的产出程序无论是提高临床治疗的效果还是细胞产出的标准化都具有重要的意义。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种能产生大量反应性极高的抗原特异性T细胞的方法，获得的T细胞无论是细胞表面受体表达还是细胞因子的分泌都是现有其它培养系统无法比拟的。用此方法无需知道特殊抗原(当然已知的抗原也可以应用)，经1-2次扩增就能达到治疗量，包含⑶4和⑶8系列的抗原特异性T细胞，而且可以根据需要分选⑶4或⑶8细胞。鉴于此，本专利技术提供的技术方案是，提供一种肿瘤抗原特异性T细胞的获取方法，包括产生和扩增方法，所述产生方法是将含有抗原提呈细胞(APC)的第一群细胞与包被有抗原的界面接触，让APC摄取包被在界面上的抗原；再将含有T细胞的第二群细胞与摄取了抗原的第一群细胞共培养，产生抗原特异性T细胞。可以采用不同的方法巧妙地把抗原包被、黏附、偶联或结合到某些物体的表面，例如交叉链接，也可以通过共价或非共价，静电或疏水基团结合的方式，或利用各种黏附方法来完成，包括化学，力学，酶学，静电等方法，最终目的是让这些包被有抗原的界面能刺激T细胞。例如，通过抗生物素蛋白或链霉亲和素使抗体与生物素化的抗原在界面结合；抗体与配体通过特异性结合到界面。另一种办法是用其它非特异性抗体结合分子，如A蛋白或G蛋白包被的界面结合抗体。化学交叉偶联法包被抗原可用Pierce, Rockford III或其它方法,抗原也可以共价结合的方式结合到界面。另外一种方法是用甲苯磺酰基激活的或环氧树脂结合的DYNABEAD 按厂家的操作步骤与多肽抗原，在磷酸缓冲液的PH 4-9. 5之间，温度4-37°C之间共培养。进一步地，所述APC直接与抗原特异性T细胞接触，与抗原特异性T细胞直接接触的APC是用磁场分离。进一步地，所述扩增方法是将抗原特异性T细胞植入包被有第一试剂的培养界面扩增，再转入包被有第二试剂的培养界面；所述第一试剂和第二试剂是相同或者不同的抗体或抗体片段；所述界面为磁珠、脂质或细胞。抗原特异性T细胞先和包被有第一试剂的界面培养，然后转入包被有第二试剂的培养界面，目的是让T细胞表面相应部位与不同试剂结合，促进抗原特异性T细胞的分蘖(扩增)。进一步地，界面的空间与T细胞的比例选择I :2，1 :2. 5,1 :5，I :25，I :50，I :75， I 100。需要说明的是，上述界面的空间与T细胞的比例是优选方案，对于本领域技术人员来说，界面的空间与T细胞的比例介于I :2至I :100均可以选择的。所述第一试剂是⑶3或⑶2抗体或其片段，所述第二试剂用⑶28抗体或其片段。⑶3抗体与⑶28抗体的比例为I :1至I :100。抗原特异性T细胞可以用针对T细胞活化标记的抗体分离，可供选择的抗体还包括CD25，CD54，CD69，CD38，CD45R0，CD49d，CD40L，CD137，CD62L 以及 CD134 等抗体。T细胞的扩增时加入促细胞分裂素、白介素15、天然⑶137蛋白、⑶137抗体、NKG2D抗体或/和天然NKG2D蛋白。优选地，所述促细胞分裂素选用植物血球凝集素(PHA)，豆蘧酸-佛波醇-乙酸酯(PMA)和离子素，脂多糖(LPS)，以及超级抗原。所述抗原为抗体/抗原复合物、肿瘤或病毒感染的细胞、固定的肿瘤或病毒感染的细胞、高温灭活的肿瘤或病毒感染的细胞、肿瘤细胞裂解物、不溶解的细胞碎片、细胞凋亡体、坏死细胞、灭活的肿瘤细胞、放射灭活的异体细胞、天然或合成的碳水化合物、脂蛋白、脂多糖、以及基因改造的细胞。对于蛋白类，糖蛋白类，多肽这些抗原亦可用于本专利技术所述的方法。抗原的获取方法有非转化细胞用3000-3600rad强度的Y射线照射；淋巴母细胞或肿瘤细胞用6000-10000rad强度的、射线照射；用理化或生物学的方法获得坏死和凋亡细胞，如用冻-溶的方法获得坏死细胞，而用紫外线照射的方法获得凋亡细胞。APC来源于外周血单个核细胞采集，淋巴结，扁桃体，活检组织，肿瘤组织，脾脏，骨髓，脐血，⑶34+细胞或单核细胞。优选地，APC来源于⑶34+细胞。抗原是通过抗体/配体的相互作用吸附或者通过化学反应的方法包被到载体的界面上。选择的抗体与相对应的配体有MARTl抗体/MARTI，WT-I抗体/WT_1，PRl抗体/PRl, PR3抗体/PR3，络氨酸酶抗体/络氨酸酶，MAGE-I抗体/MAGE-1，MUC-I抗体/MUC-1，甲胎蛋白抗体/甲胎蛋白，Her2Neu抗体/Her2Neu, HIVgpl20抗体/HIVgpl20,流感HA抗体/流感HA抗原，CMVpp65抗体/CMVpp65，C型肝炎病毒抗体/C型肝炎病毒蛋白，EB病毒EBNA 3B抗体/EB病毒EBNA 3B抗原，以及人免疫球蛋白重链和轻链抗体/来自骨髓瘤或慢性淋巴细胞性白血病患者的免疫球蛋白。用化学的方法把抗原黏附到界面上，如利用生物素-亲和素的作用。利用上述方法获得的肿瘤抗原特异性T细胞，与哺乳类癌细胞接触，能够有效地抑制肿瘤细胞生长。这些肿瘤细胞有黑色素瘤，非霍奇金氏淋巴瘤，霍奇金氏病，白血病，浆细胞瘤，肉瘤，胶质瘤，胸腺瘤，乳腺癌，前列腺癌，结肠直肠癌，肾细胞癌，胰腺癌，食道癌，脑癌，肺癌，卵巢癌，宫颈癌，多发性骨髓瘤，肝癌，急性淋巴母细胞性白血病，急性骨髓性白血病，慢性骨髓性白血病，以及慢性淋巴细胞性白血病。相关术语解释。术语“生物兼容”指的是对活细胞无明显毒性作用的特征。术语“刺激”指的是细胞表面的某些部位连接后的第一反应。例如，就受体而言，“刺激”需要细胞表面的受体与相应的信号传导系统连接来完成。有关T细胞的刺激，这样的刺激在一种情况下指的是T细胞表面部位的连接诱导信号转导的发生，例如TCR/CD3复合物的形成。刺激的发生可能激活一个细胞上调或下调一个分子的表达或分泌，例如，下调TGF-β。因此，细胞表面某些部位的连接，即使没有直接的信号转导发生，也可能导本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肿瘤抗原特异性T细胞的获取方法，包括产生和扩增方法，其特征在于，所述产生方法是将含有抗原提呈细胞（APC）的第一群细胞与包被有抗原的界面接触，让APC摄取包被在界面上的抗原；再将含有T细胞的第二群细胞与摄取了抗原的第一群细胞共培养，产生抗原特异性T细胞。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：阮润生，
申请(专利权)人：阮润生，
类型：发明
国别省市：