一种细鳞鱼Cathelicidin抗微生物肽CATH_BRALE及其基因、制备、应用，属于生物医学技术领域。CATH_BRALE的基因由909个核苷酸组成，其中编码成熟肽部分的为第439－597位核苷酸。成熟肽CATH_BRALE富含碱性氨基酸，对水产养殖常见病原菌杀菌作用很强。结构简单，不含有二硫键及环状结构，方便化学合成及基因工程制备。其对多种临床耐药菌，尤其是真菌也有较好的杀灭作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术提供一种来源于细鳞鱼(Brachymystax Ienok)的cathelicidin家族广谱抗微生物肽CATH_BRALE及其基因，制备方法和在医疗、生物制药及水产养殖病害防治中的应用，属于生物医学
技术介绍
Cathelicidin是一类由N端信号肽 区域、中间保守cathelin结构域和C端高度特异的成熟肽区域构成的具有多功能的抗菌肽家族，在几乎所有种类的动物体内(哺乳类、鸟类、两栖类和鱼类)都有发现。与防御素(defensin) —样,Cathelicidin是包括人类在内的大多数脊椎动物所特有的宿主防御肽，构成了脊椎动物自然免疫反应的关键组分，是连接自然免疫和特异性免疫的桥梁。Cathelicidin具有广谱的抗菌活性，不仅对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、某些真菌以及病毒具有非常强的杀菌活性，而且对许多临床耐药细菌同样具有作用。除此之外，Cathelicidin还具有许多其他生物学活性，如对多种免疫细胞(中性粒细胞、单核细胞、肥大细胞和T细胞)具有趋化作用、诱导肥大细胞脱粒和组织胺释放、调节巨噬细胞转录、促进伤口愈合、诱导血管发生、诱导变异细胞系细胞凋亡和淋巴细胞活化等。Cathelicidin基因的缺失或异常表达都将导致人类严重疾病的发生。最新研究发现，系统性红斑狼疮和牛皮癣的发病与人体内Cathelicidin LL-37的过度表达有关。由于具有如此众多的活性，Cathelicidin —直是国际上研究的热点。针对Cathelicidin的药用开发则蕴含着巨大的临床治疗药物制备价值。由于近年来抗生素的滥用，导致致病性微生物耐药性的问题日益严重，在临床上已经出现了大量能够完全耐受青霉素等传统抗生素的微生物。最近，一种携带编写NDM-I酶基因的“超级病菌”的出现，罪魁祸首正是抗生素的滥用和误用。这种酶可分解β_内酰胺环结构，因此可使目前为止临床最常用的抗生素，包括青霉素与头孢菌素，以及新发展的头霉素类、硫霉素类、单环内酰胺类等其他非典型内酰胺类抗生素失效。而Cathelicidin家族抗微生物肽的杀菌机制是通过破坏细菌细胞膜的完整性介导的通过静电相互作用吸引并结合到带负电的细菌细胞膜表面，进一步在细菌细胞膜上形成跨膜的孔洞，导致细菌细胞内容物的外泄,从而导致细菌细胞的死亡。除此之外,越来越多的文献报道表明抗菌肽还具有其他的杀菌机制，如抑制细菌细胞壁合成、改变细菌细胞质膜抑制隔膜形成、激活自溶素、抑制细胞内酶活性、抑制DNA、RNA和蛋白质的合成等。正是由于作用方式的不同，Cathelicidin介导的杀菌作用远远快于传统抗生素，并且不会产生耐药性。体外抗微生物测试中，大多数Cathelicidin成熟肽可以在微摩尔和亚微摩尔的浓度下快速杀死广泛的微生物。Cathelicidin成熟肽表现抗微生物肽的典型特征大多数Cathelicidin成熟肽分子量小于5000，中性pH条件下带净正电荷，缘于它们含有多个碱性氣基酸残基；富含疏水喊基，整体具有两未性的拓扑结构。目前Cathelicidin抗菌肽药物研究热点主要集中在消炎、抗感染和抗真菌等方面，应用方式可以是局部的也可以是系统的，剂型可以是口服也可以外用。尤其由于阳离子抗菌肽的表达与皮炎、侵入性烧伤脓血症、肿瘤病毒引起的肉赘等之间的病理联系，这些抗菌肽对这些疾病的局部治疗有较好的开发前景。例如中科院昆明所优选出蛇cathelicidin抗菌肽对500多株临床耐药菌株显示了较强的抗菌活性，同时具有极低的哺乳动物细胞毒性以及溶血活性，优于美国正进行III期临床的同类候选药物pexiganan;来源于猪protegrin的IB-367用于治疗肿瘤患者口腔溃疡，已进入临床III期试验。LL-37作为治疗囊肿性纤维化支气管炎的局部杀菌剂、及人抗菌肽CAP-18及其衍生物用于治疗上呼吸道感染、呼吸道感染、鼻窦炎、中耳炎等疾病的药物均已经成为生物制药领域内的研究热点。不仅限于医药领域，在农业、畜牧业和日化用品领域，cathelicidin也存在巨大的应用潜能。我国是渔业大国，水产品总产量位居世界首位。但是，近几年，随着高密度、集约化养殖模式的发展，水环境的污染程度加重，各种细菌性和病毒性疾病频发，防治疾病大量使用抗生素破坏水环境的微生态平衡，导致某些病原体对药物产生了耐药性，危害人体健康等。相继发生的水产养殖或水产品加工过程中过量使用渔用药物或加入禁用药物导致的 “孔雀石绿事件”、“多宝鱼事件”、“氯霉素事件”等，给水产业蒙上一层浓厚的阴影，对消费者的人身安全造成威胁，也因此食品安全问题更加受到人们的关注。近年来，我国已有研究利用抗菌肽替代传统抗生素针对抗水产养殖过程中常见病原菌，如嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、梅氏弧菌(Vibrio metschnikovi)、迟纯爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)及温和气单胞菌(Aobria)均有较好的抑菌效果。通过饲料摄入抗菌肽，对南美白对奸亲虫下产卵、孵化率及虾苗饲养，和对成虾的饲养效果明显优于金霉素。抗菌肽制品在对虾的饲料或水体中能对水中的微生物加以控制，使致病微生物如弧菌等均能杀灭，通过饲料摄入虾体内能提闻免疫力和促进生长等功效。由于世界范围内对Cathelicidin的研究历史并不长，我国在此类活性多肽家族的研究还鲜有报道。细鳞鱼(Brachymystax lenok)属鲑科,细磷鱼属，生长在高寒冷水区域，是重要的冷水性经济鱼类。由于肉质鲜美，过量捕捞，已列入我国国家二级保护动物名单。本次专利技术的细鳞鱼抗微生物肽CATH_BRALE，将其全序列氨基酸结构经NCBI蛋白质数据库进行搜寻比对，未发现有任何相同多肽。专利技术人将本专利技术的细磷鱼CATH_BRALE编码基因经NCBI基因数据库进行搜寻比对，未发现有任何相同基因。
技术实现思路
本专利技术提供一种在亚微摩尔剂量下即具有很强的抗微生物活性的来源于细鳞鱼的一种抗微生物肽，CATH_BRALE及其基因、化学合成方法和应用。本专利技术的目的是基于上述理论研究和现有技术基础，提供一种具有强烈的抗菌活性，尤其针对水产养殖中几种常见病原菌的细磷鱼CATH_BRALE及其应用，着重水产养殖领域。为了实现本专利技术的目的，本专利技术提供了如下技术方案CATH_BRALE是细鳞鱼Cathelicidin基因编码的一种直链多肽，含有53个氨基酸残基，理论等电点(Pl)为12. 43，理论分子量为5200. 6，含有15个碱性氨基酸残基(11个精氨酸和4个赖氨酸)，含有两个酸性氨基酸残基(天冬氨酸)，静电荷为+13，说明它是一种较强的碱性多肽。CATH_BRALE不含半胱氨酸，因此没有分子内和分子间二硫键，结构简单。cath_brale全序列为精氨酸-精氨酸-丝氨酸-赖氨酸-丙氨酸-精氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸-甘氨酸-丝氨酸-赖氨酸-甲硫氨酸-甘氨酸-精氨酸-赖氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-赖氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸-甘氨酸-精氨酸-脯氨酸-甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸-脯氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸-丝氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-精氨酸-甘氨酸-甘氨酸-本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种细磷鱼Cathelicidin家族广谱抗微生物肽CATH_BRALE，是细鳞鱼Cathelicidin基因编码的一种直链多肽，富含碱性氨基酸，其全序列为：精氨酸？精氨酸？丝氨酸？赖氨酸？丙氨酸？精氨酸？甘氨酸？甘氨酸？丝氨酸？精氨酸？甘氨酸？丝氨酸？赖氨酸？甲硫氨酸？甘氨酸？精氨酸？赖氨酸？天冬氨酸？丝氨酸？赖氨酸？甘氨酸？甘氨酸？丝氨酸？精氨酸？甘氨酸？精氨酸？脯氨酸？甘氨酸？丝氨酸？甘氨酸？丝氨酸？精氨酸？脯氨酸？甘氨酸？甘氨酸？甘氨酸？丝氨酸？丝氨酸？异亮氨酸？丙氨酸？甘氨酸？丙氨酸？丝氨酸？精氨酸？甘氨酸？天冬氨酸？精氨酸？甘氨酸？甘氨酸？苏氨酸？精氨酸？天冬酰胺？丙氨酸。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：于海宁，王义鹏，厉政，张嵩岩，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：
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