用于生产丝纺丝液的方法技术

本发明专利技术涉及生产包含具有卷曲螺旋结构的丝蛋白如蜜蜂丝蛋白的丝纺丝液的方法。所述丝蛋白从生产它们的细胞中获得，通过采用表面活性剂或离子液体接触它们使所述蛋白溶解并且浓缩所述蛋白来生产丝纺丝液。所述蛋白质能够用于多种用途如个人护理用品、塑料、纺织物和生物医学产品的生产。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及生产包含具有卷曲螺旋结构的丝蛋白如蜜蜂丝蛋白的丝纺丝液的方法。所述丝纺丝液能够用于多种目的如个人护理用品、塑料、纺织物和生物医学产品的生产。
技术介绍
丝是由种类繁多的昆虫和蜘蛛物种生产的蛋白纤维。家蚕(Bombyx mori)的丝作为缝合生物材料已被使用数百年。为了在转基因系统中克隆和表达蚕或蜘蛛的丝的许多努力已经发现这是非常艰巨的任务(海格力斯任务，Herculean task)。这些丝基因的大尺寸和高度重复性序列使得它们顽抗在专门的丝腺以外表达，并且导致低蛋白质产率。尽管蚕茧和蛛网是最为人所熟知的丝，但是其他物种可以生产更适于转基因生产的丝。意大利蜜蜂(Apis mellifera)幼虫纺出丝苗,它们在其中孵化成蛹。蜜蜂丝由四个小的(每一个 30 kDa)和非重复性的纤维基因编码(Sutherland等人，2006)。四个基因的同源组也已经在大黄蜂、斗牛犬蚁、黄猄蚁、川军蜂和亚细亚蜜蜂中被发现(Sutherland等人，2007 ；Sezutsu 等人，2007 ；Shi 等人，2008 ；W0 2007/038837)。老式的X射线纤维衍射研究证明蜜蜂丝含有排列成卷曲螺旋构象的α -螺旋蛋白，最可能为四聚卷曲螺旋结构(Atkins, 1967),具有可能对应于四种不同的丝蛋白的四条链。生物信息学技术预测所述蜜蜂丝蛋白序列的每一种均含有60-68%的卷曲螺旋(Sutherland 等人，2006)。丝线能够从蜜蜂幼虫的所述丝腺中被拉伸出来。这些线与蚕丝纤维相比强度较弱但是延展性和韧性较好(Hepburn等人，1979)。Shi等人(2008)最近报道了亚细亚蜜蜂(Apis cerana)丝的重组生产。四种亚细亚蜜蜂丝蛋白在大肠杆菌中被表达成可溶的形式，具有每升酵素10-60 mg的产率。使用多种实验技术来描述低浓度下(O. 03至0.2重量％)所述蛋白质的结构和相互作用的特征。这些确凿地证明既非单独的蛋白质亦非四种蛋白质的混合在溶液中具有紧密的三级包装。所述蛋白质作为单体或疏松的关联二聚体存在并且具有几乎不含α-螺旋结构的高度随机的螺旋构象。需要有更深入的方法用于由能够用于制造种类繁多的产品的重组表达的卷曲螺旋丝蛋白来生产丝纺丝液。
技术实现思路
本专利技术人惊奇地发现表面活性剂和离子液体能够用在生产包含卷曲螺旋丝蛋白的丝纺丝液的方法中。在第一方面中，本专利技术提供了，所述方法包含i)裂解生产一种或多种丝蛋白的细胞，ii)通过采用表面活性剂或离子液体接触它们使所述丝蛋白溶解，和iii)浓缩所述丝蛋白来生产丝纺丝液，其中所述一种或多种丝蛋白能够形成包含卷曲螺旋结构的三级结构。在一个实施方案中，所述丝蛋白被浓缩，通过a)通过加入沉淀所述表面活性剂的化合物来减少溶液中所述表面活性剂的量，和b)从在步骤a)中形成的所述沉淀中分离包含所述丝蛋白的溶液以生产所述丝纺丝液。能够用于沉淀表面活性剂的化合物是本领域已知的并且包括盐或碳水化合物；或其两种或多种的组合。优选地，所述盐是钾盐或钠盐。在一个实施方案中，所述碳水化合物是α-环糊精。 在另一个实施方案中，所述丝蛋白通过过滤被浓缩，更优选膜过滤，并且甚至更优选正切流动过滤。在一个实施方案中，所述方法进一步包含增加所述丝纺丝液中丝蛋白的浓度。这通过本领域已知的任何方法能够被实现。例如，所述丝纺丝液对抗脱水溶液被滤膜分析，如包含吸湿性聚合物的溶液。吸湿性聚合物的实例包括，但不限于，聚乙二醇、淀粉酶和丝胶，或其两种或多种的组合。在一个优选的实施方案中，所述丝纺丝液包含至少大约O. 5%w/v的丝蛋白。在另一个实施方案中，所述丝纺丝液包含大约O. 5%至大约15%的丝蛋白。所述细胞能够是任何细胞类型，典型地是包含编码所述丝蛋白的外源性多聚核苷酸，并且能够生产所述丝蛋白的重组细胞。实例包括，但不限于，细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或动物细胞，或其两种或多种的组合。在一个优选的实施方案中，所述细胞是细菌细胞。在一个特别优选的实施方案中，所述细菌细胞是大肠杆菌。在一个优选的实施方案中，步骤i)进一步包含从已裂解的细胞中分离包涵体。所述方法还可以包含在步骤i)之前培养所述细胞。在一个优选的实施方案中，所述丝蛋白能够形成包含卷曲螺旋结构的三级结构的部分包含七肽序列abcdefg的至少10个拷贝，并且其中处于位置a和d上的至少25%的氨基酸是丙氨酸残基。更优选地，处于位置a、d和e上的至少25%的氨基酸是丙氨酸残基。在另一个优选的实施方案中，所述丝蛋白包含如下序列，更优选基本上由如下序列组成，甚至更优选由如下序列组成，所述序列选自a)如 SEQ ID NO I 至 8、17 至 24、33 至 40、49 至 56、65 至 72、81 至 88、97 至 98 中任一个所提供的氨基酸系列，b)与 SEQ ID NO I 至 8、17 至 24、33 至 40、49 至 56、65 至 72、81 至 88、97 至 98 中任一个或多个至少30%相同的氨基酸系列，和c) a)或b)的生物学活性片段。在以上方面，优选丝蛋白尽可能少地从细胞分泌。相应地，优选丝蛋白不包含N末端信号系列。对于以上方面特别有用的丝蛋白的例子包括但不局限于，包含如下序列、更优选基本上由如下序列组成、甚至更优选由如下序列组成的丝蛋白，所述序列选自a)如 SEQ ID NO 1、3、5、7、17、19、21、23、33、35、37、39、49、51、53、55、65、67、69、71、81、83、85、87或97中任何一个所提供的氨基酸序列，b)与 SEQ ID NO 1、3、5、7、17、19、21、23、33、35、37、39、49、51、53、55、65、67、69、71、81、83、85、87或97中任何一个或多个至少30%相同的氨基酸序列，和c) a)或b)的生物学活性片段。在一个实施方案中，所述丝蛋白能够是许多相同的丝蛋白或是两种或多种不同的丝蛋白的组合。在一个优选的实施方案中，如果使用不同的丝蛋白，那么就是四种不同的丝蛋白。在另一个实施方案中，所述丝蛋白包含第一丝蛋白，所述第一丝蛋白包含，更优选基本上由其组成，甚至更优选由其 组成，a)如 SEQ ID NO 1、2、17、18、33、34、49、50、65、66、81 或 82 中任何一个所提供的氨基酸序列；b)与 SEQ ID NO 1、2、17、18、33、34、49、50、65、66、81 或 82 中任何一个或多个至少30%相同的氨基酸序列；和c) a)或b)的生物学活性片段，第二丝蛋白，所述第二丝蛋白包含，更优选基本上由其组成，甚至更优选由其组成，d)如 SEQ ID NO 3、4、19、20、35、36、51、52、67、68、83 或 84 中任何一个所提供的氨基酸序列；e)与 SEQ ID NO 3、4、19、20、35、36、51、52、67、68、83 或 84 中任何一个或多个至少30%相同的氨基酸序列；和f) c)或d)的生物学活性片段，第三丝蛋白，所述第三丝蛋白包含，更优选基本上由其组成，甚至更优选由其组成，g^BSEQ ID NO 5、6、21、22、37、38、53、54、69、70、85 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·D·萨瑟林，V·S·阿里托，A·西斯卡塔，S·韦斯曼，M·G·胡森，J·S·丘奇，
申请(专利权)人：联邦科学工业研究组织，
类型：发明
国别省市：