一种酶信号循环放大高灵敏免疫检测方法技术

本发明专利技术涉及酶联免疫（ELISA）领域，特别是一种抗HRP多抗-HRP复合物应用于ELISA技术，从而获得酶信号循环放大。基于酶信号循环放大免疫检测方法，适合于各种类型的基于酶信号放大的免疫检测系统，该免疫检测系统的优势是能够最大程度上提高其检测灵敏度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫检测
，特别涉及一种基于酶信号循环放大超灵敏免疫检测方法，属于酶联免疫(ELISA)

技术介绍
酶联免疫(ELISA)技术是现代免疫分析中较为重要的一项技术，尤其是基于ELISA技术的各种类型的初筛试剂盒在临床检验、食品安全领域得到广泛的应用。这项检测技术中有3项必要的试剂①固相的抗原或抗体酶标记的抗原或抗体；③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法，如双抗体夹心测抗原、双抗原夹心测抗体、间接法测抗体、竞争法等模式。ELISA技术检测不同的项目，其检测灵敏度和相应的抗原及抗体有着紧密联系，而随着检验检疫要求越 来越严格，对方法灵敏度的要求越来越高，而基于传统的ELISA技术在灵敏度方面往往提闻空间有限，也只能依赖提闻抗原抗体的未和力，从而间接提闻其检测灵敏度。
技术实现思路
针对当前ELISA技术发展趋势的需求如何有效的提供其检测灵敏度，本专利技术所要解决的技术问题就是在原有的ELISA检测体系基础之上，进行创新型设计以获得更高的检测灵敏度。本专利技术的创新主要在于在原有的ELISA检测体系中引入“抗酶抗体-酶标记复合物”如兔抗辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase, HRP)多抗-HRP复合物,兔抗HRP-碱性磷酸酶(Alkaline phosohatase, AP)复合物等，以达到更高的检测灵敏度。本专利技术的目的在于提供一种基于酶信号循环信号放大的ELISA检测系统。本专利技术的另一目的在于提供一类“抗酶抗体-酶标记物”制备方法及其应用于传统ELISA技术中。本专利技术的再一目的是利用一类“抗酶抗体-酶标记物”实现传统ELISA中酶信号的循环放大，从而提高检测灵敏度。本专利技术的目的通过以下技术方案实现一类抗酶抗体-酶标记物的制备并应用于传统ELISA技术中。针对HRP显色体系，制备抗HRP多抗-HRP复合物；针对AP显色体系，制备抗AP多抗-AP复合物；也可能制备其他类型显色酶抗体酶标复合物及其不同类型显色酶抗体-酶交叉制备的复合物，此类复合物能够实现酶信号的循环放大，提供传统ELISA检测体系的灵敏度，本说明书以HRP为例进行来描述本专利技术的设计模型。本专利技术的技术方案是首先通过多抗制备技术获得抗HRP多抗，并与一定量的HRP进行亲和反应形成抗HRP多抗-HRP复合物。选取某一 ELISA检测模型如双抗夹心检测HBsAg建立基于酶信号循环放大的新型ELISA检测体系。上述抗HRP多抗-HRP复合物的制备流程及检测系统构建具体可以包括下述步骤(I )、用纯化的HRP免疫兔，得到含有抗HRP抗体的兔血清；先用(NH4) 2S04沉淀法从兔的血清中初步纯化免疫球蛋白IgG,再用ProteinA-Sepharose亲和层析柱进一步纯化抗HRP的IgG, SDS-PAGE及Western blotting鉴定分离纯化的抗HRP多抗；(2)、取上述纯化后的抗HRP多抗，加入一定量的HRP形成不饱和的抗HRP多抗-HRP复合物，此复合物不仅具有HRP酶活性，而且仍然具有与HRP酶反应的活性位点；(3)、应用举例I :双抗夹心法检测乙肝表面抗原(HBsAg)的基础之上，引入抗HRP多抗-HRP复合物，在ELISA显色步骤之前加入上述抗HRP多抗-HRP复合物反应30min后进行洗涤，再进行酶显色步骤；(4)、应用举例2 :间接法测口蹄疫病毒(FMDV)抗体ELISA试剂盒基础之上，引入抗HRP多抗-HRP复合物，在ELISA显色步骤之前加入上述抗HRP多抗-HRP复合物反应30min后进行洗涤，再进行酶显色步骤。本专利技术提供了抗HRP多抗-HRP复合物的制备方法，该复合物能够用于ELISA检测体系中，形成基于酶信号循环放大免疫检测系统，能够远远的提高检测的灵敏度。附图说明图I酶信号循环放大应用实例I-双抗体夹心ELISA模式。图2酶信号循环放大应用实例2-间接法测抗体ELISA模式。具体实施例方式实施例是对本专利技术所提供的抗HRP多抗-HRP复合物的制备及应用到酶信号循环放大系统应用举例的进一步说明，但专利技术的实施方式不限于此，对于其他方式的ELISA，该专利技术策略同样适用。实施例I抗HRP多抗-HRP复合物的制备 (O油包水抗原乳化剂的制备 用弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂I. 2mL混合2 mg纯化HRP，用匀浆器混合2小时，将制好的乳化剂滴入盛有冷水的烧杯中，若一滴乳化剂状态完整地停留在水面上，而不扩散，表明形成稳定的油包水抗原乳化剂。(2)免疫新西兰大白兔 选取4周大的，体重约I. 5Kg的健康新西兰大白兔2只。先将新西兰大白兔背部的毛小心剪去，然后取600 μ L制备好的油包水抗原乳化剂，用微量注射器多位点地进行皮下注射，一只动物背部两侧注射总数约为8 10点，使抗原能缓慢扩散，每隔Γ2周免疫一次，观察注射点是否红肿，如果糜烂可用紫药水收干。在免疫3-4次后，从兔子的耳缘静脉抽血约lmL，离心IOmin后，得血清可进行效价鉴定。共进行6次免疫，在末次免疫后5天后采用颈动脉放血法取血。(3)颈动脉放血法 在大白兔颈外侧做皮肤切口，拉开皮肤后可见斜行的胸锁乳突肌，将此肌钝性分离并推向后方，即可见到淡红色有弹性的总动脉。将此动脉轻轻游离(连同与之同行的迷走神经)，用丝线将远心端结扎，近心端用止血钳夹住，另一止血钳夹住动脉迷走神经，用以固定。沿结扎处剪断血管，用固定止血钳将断端钳住，插入输血针管，慢慢打开夹持的止血钳，动脉血立即通过输血针管流入瓶中。采用室温自然凝固分离抗血清，然后放置37°C I小时,再4°C过夜，待凝块收缩，4000rpm离心15分钟，收集上清。(4)抗血清的纯化 饱和硫酸铵溶液取500ml蒸馏水加热至70 80°C，将400g硫酸铵溶于其中，搅拌20min，冷却。待硫酸铵结晶沉于瓶底,其上清即为饱和硫酸铵。在使用前用28%氨水调PH7. O。用55%饱和硫酸铵提取血清I份加生理盐水I份混匀，然后逐滴加入饱和硫酸铵2份中，边加边搅拌，防止形成团块降低沉淀物的特异性.混匀后静置30min或置4°C冰箱过夜。低温高速10 000/min离心IOmin,将上清液(含白蛋白)弃去，取沉淀物(含球蛋白)溶于少量生理盐水中。用33%饱和硫酸铵提取将上述提取物生理盐水溶液2份加I份饱和硫酸铵。然后再10 000/min离心，其余操作同上。用33%饱和硫酸铵重复上述步骤提取一次。将提取物装入透析袋，在生理盐水中透析，以除去其中所含的硫酸铵。放_20°C冰箱保存。按照ProteinA-Sepharose亲和层析柱纯化试剂盒操作说明书进行抗体的进一步纯化。并采用SDS-PAGE及Western blotting鉴定分离纯化的抗HRP多抗。 (5 )抗HRP抗体-HRP复合物的制备 取纯化好的HRP抗体10mg，加入一定量的HRP，二者亲和而成不饱和抗HRP抗体-HRP复合物，装入透析袋，在生理盐水中透析，放_20°C冰箱保存。实施例2酶信号循环放大高灵敏免疫检测乙肝表面抗原系统(双抗体夹心测抗原) (I)材料准备 HBsAg包被板取抗HBsAg多抗，用PH 9. 6碳酸盐缓冲液稀释终浓度5_8 ug /ml，包本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于酶信号循环放大免疫检测方法的构建，其特征在于：采用抗HRP多抗？HRP复合物进行酶信号的循环放大，而不仅仅限于HRP，也可是其他类型的酶如碱性磷酸酶AP等。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张恒，汤慕瑾，吕敬章，谢丽琪，岳振峰，万志刚，蓝芳，黄李华，范放，洪小柳，蔡伟增，陈昊翰，
申请(专利权)人：深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：