本发明专利技术提供一种高产杆状病毒的转基因脂肪体细胞系及其制备方法和应用，该细胞系的名称为IOZCAS-Spex?X，保藏号为CGMCC?No.4505；所述的转基因脂肪体细胞系的制备方法，包括以下步骤：培养甜菜夜蛾脂肪体细胞；将含人端粒酶逆转录酶基因转化入已知表达载体中，获得重组表达载体；将所述重组表达载体导入所述的甜菜夜蛾脂肪体细胞中；和使所述甜菜夜蛾脂肪体细胞能够表达人端粒酶逆转录酶，获得转基因脂肪体细胞系；及所述转基因昆虫细胞系在杆状病毒生产中的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种转基因昆虫细胞系，尤其涉及一种高产杆状病毒的转基因脂肪体细胞系及其制备方法和应用，属于转基因动物
技术介绍
昆虫是世界上种类最多的生物群体，有着丰富的细胞遗传学系统。昆虫细胞系的主要用途表现在作为研究材料，一直是生理学、发育生物学、细胞生物学、分子生物学和生物化学等科学研究的重要工具；作为杆状病毒表达载体系统的重要组成部分，可表达具有重大经济价值和科学意义的外源蛋白质；作为生物反应器，扩增昆虫杆状病毒，特别是含有外源基因的重组杆状病毒，生产生物杀虫剂。据报道，在1965年第一株昆虫细胞系成功建立后至今，近40年的时间内，已经建立的昆虫细胞系超过500种。它们分别来源于鳞翅目、双翅目、同翅目、膜翅目、直翅目和鞘翅目等170多种昆虫，其中大部分来源于鳞翅目和双 翅目昆虫。鳞翅目的细胞系来源于多种组织，包括卵巢、胚胎、血细胞、脂肪体等。昆虫的脂肪体同哺乳动物的肝脏具有相似的功能，是重要的生理代谢组织，也是杆状病毒主要的侵染、复制部位之一，具有重要的应用价值。昆虫细胞系的建立往往需要消耗大量的时间和精力。细胞在体外培养过程中，由于受到各种环境因子的影响，有时会发生自发转化，由原来的二倍体核型转变成多倍体/异倍体核型，细胞的生长特性发生改变而获得永生化。永生化的细胞在生长过程中失去接触抑制，可无限繁殖传代。这样的转化不仅时间长，而且转化率极低。建立一株细胞系往往需要培养大量原代细胞，费时费力，经常守株待兔式地等待细胞自发转化，条件难以控制，常常因污染而前功尽弃。而且体外培养细胞成功传代后，当培养到一定代数时，通常会进入生长抑制状态，生命力明显减弱，增殖能力下降，生长停滞并最终死亡。人工诱导体外培养细胞转化是获得永生化细胞的重要手段。在人工设计的诱变因素下使细胞发生转化，通常只需1-3个月就可实现，而且转化率较高，传代细胞生长周期长、性状稳定。目前发现，细胞永生化与端粒和端粒酶关系密切。端粒与端粒酶是真核细胞染色体末端的一种特殊结构，由端粒DNA和端粒蛋白质组成。端粒DNA是富含G的高度保守的重复核苷酸序列，参与DNA复制，并对维持染色体的稳定和完全复制有重要作用。人类细胞端粒是由10-15kb的重复序列(TTAGGG)n组成；在植物中端粒以(TTTAGGG)η重复序列出现；昆虫细胞端粒一般是由6-8kb的重复序列(TTAGG)组成。目前已知，在昆虫中存在三种端粒DNA类型家蚕(Bombyx mori)的端粒DNA由重复序列(TTAGG)n构成(Okazakiet al. 1993);果妮(Drosophila melanogaster)端粒 DNA 由转座因子 HeT-Α 和 TART 组成(Biessmann et al. 1990, Levis et al. 1993);摇蚊中的端粒DNA由复杂的基因串联重复序列组成(Nielsen & EdstroEm 1993, Zhang et al. 1994)。体外培养的细胞每分裂一次，端粒缩短50-200bp,当缩短至一临界值时,细胞就会停止分裂,走向衰老和死亡。端粒酶是一种核糖核蛋白酶，由RNA和蛋白质组成，具有逆转录酶的功能，以自身的RNA为模板合成端粒DNA，以维持端粒的长度。细胞永生化是指体外培养的细胞由于自身的改变或外部条件的影响，逃离细胞的衰老期和危机期，端粒长度始终维持稳定，从而获得无限增殖能力的过程。细胞永生化与端粒酶激活密切相关。端粒的维持依赖于端粒酶的激活。在原代培养的细胞中稳定表达人端粒酶逆转录酶基因(human telomerase catalytic subunit,hTERT)能稳定端粒的长度,使细胞易于永生化(Cemi C. Telomeres, telomerase, and myc.An update . Mutat Res. 2000，462 (I) :31-47.)。虽然有关将端粒酶基因应用于哺乳动物细胞永生化的报道很多，但未见涉及利用转染人端粒酶基因获得昆虫永生化细胞系的报道。通过人工诱导体外转化方法建立来源于昆虫脂肪体并表达人端粒酶逆转录酶基因的细胞系，为获得永生化细胞系提供了重要途径。
技术实现思路
因此，本专利技术的目的是针对目前尚无含有人端粒酶昆虫细胞系的不足，提供一种高产杆状病毒的转基因脂肪体细胞系，其含有人端粒酶逆转录酶基因，为获得永生化昆虫细胞系提供了重要途径。本专利技术的另一目的是提供一种高产杆状病毒的转基因脂肪体细胞系的制备方法。 本专利技术的再一目的是提供一种高产杆状病毒的转基因脂肪体细胞系的应用。针对上述目的，本专利技术的技术方案如下本专利技术一方面提供了一种高产杆状病毒的转基因脂肪体细胞系，该细胞系的名称为IOZCAS-SpexX，该细胞系的保藏号为CGMCC No. 4505。优选地，所述转基因脂肪体细胞系含有人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)。优选地,所述人端粒酶逆转录酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO I所示。本专利技术的又一方面提供了一种高产杆状病毒的转基因脂肪体细胞系的制备方法，包括以下步骤步骤I :培养甜菜夜蛾脂肪体细胞；步骤2 :将含人端粒酶逆转录酶基因转化入已知表达载体中，获得重组表达载体；步骤3 :将所述重组表达载体导入所述的甜菜夜蛾脂肪体细胞中；和步骤4 :使所述甜菜夜蛾脂肪体细胞能够表达人端粒酶逆转录酶，获得转基因脂肪体细胞系。优选地，在步骤I)中，所述培养甜菜夜蛾脂肪体细胞，包括以下步骤步骤I. I :将甜菜夜蛾末龄幼虫浸没在3%次氯酸溶液中5分钟，75%乙醇溶液中10-20分钟，进行表面消毒，然后用无菌蒸馏水清洗昆虫，再吸干蛹表面水分；步骤I. 2 :解剖昆虫，取出甜菜夜蛾脂肪体组织；步骤I. 3 :用生理盐水清洗步骤2中获得的组织2-3次，再用细胞培养液I清洗，清洗后把该组织放入含有ImL细胞培养液I润洗过的细胞培养瓶中，盖紧瓶盖，放入27°C无光照的细胞培养箱中培养24小时；步骤I. 4 :加入适量的细胞培养液I，使组织完全或大部分浸没在该培养液中，在与步骤I. 3同样条件下培养；步骤1.5 :每7-10天吸出半量的培养液，并同时换入半量新的细胞培养液II，直至观察到不断扩展并开始增殖的细胞充满了整个培养瓶。优选地，在步骤2中，所述已知的表达载体为pIZT-V5_His或pIB-V5_His。优选地，在步骤3)中，所述重组表达载体通过脂质体导入所述的甜菜夜蛾脂肪体细胞中。优选地，在步骤4)中，具体通过以下步骤获得转基因昆虫细胞系步骤4. I :放入与步骤I. 3同样条件下培养至少4小时，并不时晃动。转染后换适量细胞培养液II继续在与步骤I. 3同样条件下培养；步骤4. 2 72小时后荧光倒置显微镜观察转染效果，换含有真核细胞筛选抗生素的细胞培养液III继续与步骤I. 3同样条件下培养；步骤4. 3 :在将该细胞与步骤I. 5相同培养细胞，直至获得转基因昆虫细胞系。上述整个过程都是在无菌条件下进行的；其中所述的四种细胞培养液分别是细胞培养液I是昆虫细胞培养液与青霉素、链霉素、苯基硫脲和胎牛血清的混合物；细胞培养液II是昆虫细胞培养液与青霉素、链霉素和胎牛血清的混合物，细胞培养液III是昆虫细胞 培养液与青霉素、链霉素、博莱霉素(Zeocin)和胎牛本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高产杆状病毒的转基因脂肪体细胞系，该细胞系的名称为IOZCAS？Spex？X，保藏号为CGMCC？No.4505。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张寰，李瑄，秦启联，王雁玲，王红托，张继红，苗麟，张宁，孟茜，朱未，周桂灵，杨青，
申请(专利权)人：中国科学院动物研究所，
类型：发明
国别省市：
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