一种纯化包涵体蛋白并复性的方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，提供了一种纯化包涵体蛋白的方法，该方法为将溶解的包涵体蛋白在离子交换层析柱中进行变性剂浓度的梯度洗脱货pH值的梯度洗脱或同时进行变性剂的浓度梯度洗脱及pH值的梯度洗脱。本发明专利技术在离子交换层析复性的基础上，提供了能使变性蛋白或者包涵体蛋白快速、简便的纯化的工艺，在蛋白纯化的同时，也可以达到了蛋白复性的目的；与其他的复性方法相比，两种流动相的设置，大大简化了操作步骤，提高了蛋白在高浓度下的复性的效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及。
技术介绍
蛋白质的纯化和复性问题是生物工程中的难点和热点，不仅涉及到分子生物学、细胞生物学等的重大的问题，而且涉及到目前基因工程产品的生产和成本，尤其对大规模生产药用蛋白。一股复性方法存在的缺点是主要是低浓度下的低复性率，使得整个工艺过程需要大量的缓冲液、大体积的容器、大量的操作时间，这些大大降低了生产的效率，增加了生产成本。聚集体的形成是低活性收率的主要原因。当蛋白在高浓度下折叠复性时，伸展的肽链由于疏水基团的外露，更加的容易由于疏水相互作用或者分子间的错配的二硫键形成聚集体。由于聚集体的形成至少涉及到两个蛋白多肽链，所以是二级或者更高级的反应，蛋白的浓度越高，聚集体的形成就越快、越多，这大大制约了包涵体蛋白的大量生产。 目前国内外工业生产中最经常使用的复性手段有稀释复性法、透析复性法等。稀释法复性蛋白是将包涵体蛋白用复性缓冲液直接进行稀释，而达到其复性的目的，存在着复性时间长、缓冲液用量大、容器体积大、不适合大规模生产；而透析法复性蛋白是将包涵体蛋白放在透析袋中，用不断更换的复性缓冲液逐步将袋中的变形剂透析出来，而达到其复性目的，缺点在于容易造成蛋白与透析膜之间的吸附，并且由于需要经常更换复性缓冲液，增加了操作步骤和操作时间；这两种方法都存在缓冲液体积大，不仅给后续的村话工艺带来了不便，增加了缓冲液的使用量，提高了生产成本，而且要增大设备的处理量，不适于工业生产。层析方法是生物技术中最经常使用的分离手段。层析介质及层析环境对蛋白比较温和，处理的蛋白的浓度可以很高，操作简单，完成操作需要的时间短，所以最近也被用来进行复性。利用凝胶过滤层析进行复性是新近发展的复性手段，蛋白在通过凝胶过滤层析介质的同时脱去了变性剂，蛋白发生折叠复性；但是这种过程中变性剂的瞬间脱落，也容易造成聚集体的形成，不溶性的聚集体会造成柱子的堵塞；凝胶过滤层析本身对上样量限制的要求同样限制了这种方法的工业应用。层析法复性蛋白还包括疏水层析法和离子层析法，都是将蛋白包涵体在层析柱上直接吸附。疏水层析法的步骤为(I)先将层析柱用高盐缓冲液平衡，(2)蛋白进柱，进行吸附；(3)降低盐浓度，将蛋白洗脱出来；该方法完全除去变性剂，并使蛋白在层析介质上折叠复性，但是这种方法仅适于表明疏水很强的蛋白质，否则疏水层析使用的高浓度的盐离子容易造成蛋白的盐析沉淀。并且一些蛋白在高盐的情况下的活性不高，而离子层析法的步骤为(I)先将层析柱用低盐或无盐缓冲液平衡，(2)蛋白进柱，进行吸附，(3)提高盐浓度，将蛋白洗脱出来；但该方法一股都用于复性后的蛋白的纯化过程(CN 1064968C, US4705845，US 4705848，EP 0505846AI,W0 00/03011)，并没有直接使用离子交换层析复性融合蛋白，但是没有洗脱过程的双梯度的设置，难免出现聚集体和错误的二硫键的配对，降低了复性的收率。并且把处在高浓的变性剂条件下的变性蛋白加入到没有变性剂的柱子中时，因为变性剂浓度的瞬时降低，大大增加了聚集体形成的可能。使用不含变性剂的缓冲液复性后的蛋白，不仅仅降低了复性的收率，而且一些目标蛋白吸附在层析介质上没有洗脱出柱，使蛋白的质量回收很低，并且污染了层析柱。有人使用此种过程复性变性的天然溶菌酶蛋白，蛋白的质量收率仅仅在10%左右。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高浓度条件下，高效纯化包涵体蛋白质的方法。本专利技术提供了一种纯化包涵体蛋白的方法，该方法为将溶解的包涵体蛋白在离子交换层析柱中进行变性剂浓度的梯度洗脱货PH值的梯度洗脱或同时进行变性剂的浓度梯度洗脱及PH值的梯度洗脱其具体步骤是I)酸性/碱性流动相I或者其它溶液溶解的包涵体蛋白进经流动相I平衡后的离子交换层析柱，包涵体蛋白可逆地被吸附在层析介质上； 2)然后用酸性/碱性流动相11梯度取代酸性/碱性流动相I对包涵体蛋白溶液进行梯度洗脱，洗脱梯度长度为1-5个的柱体积，流动相II中的变性剂的浓度低于流动相I中的变性剂的浓度所述的变性剂为脲、Triton或Tween ;在流动相I中的浓度为6 lOmol/L ;在流动相II中的浓度为O. 5 3mol/L ;所述的流动相I为酸性缓冲液，pH为3 7 ;流动相II为碱性缓冲液，PH为8 11 ;流动相I为碱性缓冲液，pH为8 11 ;流动相II为酸性缓冲液，PH为3 7 ;所述的酸性缓冲液为含单一硼酸盐、醋酸盐或碳酸盐的酸性缓冲液或为混合酸性缓冲液；所述的离子交换层析介质可为DEAE Sepharose Fast Flow、SP SepharoseFast Flow、Q Sepharose Fast Flow 或 CM Sepharose Fast Flow。蛋白质复性过程中，变性剂的除去是影响蛋白复性收率的关键步骤。本专利技术采用高浓度变性剂可使致密的包涵体溶解，如脲的浓度在6 10mol/L，盐酸胍的浓度为4 8mol/L时，蛋白的多肽链以伸展的形式存在；高浓度的变性剂条件下，蛋白多肽链之间不会因为疏水相互作用形成聚集体；理论上说，除去变性剂及其他的使蛋白解折叠的因素，多肽链可以逐步折叠复性。但是，一股传统的复性方法，是使变性剂浓度瞬时降低，甚至降到零点，这样，蛋白在折叠时，会产生一些折叠中间体，这些中间体具有较强的疏水表面，由于此时变性剂浓度很低，不再具有溶解聚集体的作用，聚集体就会大量产生，有时甚至观察到复性溶液中白色的沉淀。而本专利技术采用的变性剂浓度逐渐降低的梯度洗脱或PH值逐渐降低或升高的梯度洗脱；可在此过程中逐步折叠复性，满足了蛋白多肽链各个疏水部位逐步包埋的需要；既可提高蛋白复性的效率，降低聚集体的形成；同时，最终蛋白的缓冲液中含有低浓度的变性剂(脲为2 3mol/L，盐酸胍为I 2mol/L)，可以增加复性后的蛋白肽链的柔韧性，明显提高蛋白的复性效率。一股蛋白，当缓冲液中的pH值离蛋白的等电点越远，蛋白之间形成聚集体或者蛋白形成沉淀的可能性就越小；同时，不同的蛋白，不同折叠程度时的稳定性，对PH有不同的要求，蛋白最适活性的PH值也有不同；这样，选用不同的pH值，在一个pH值下使变性的蛋白稳定，并有助于其他的操作，而蛋白折叠时的PH值的逐步变化，可以大大稳定蛋白的折叠的构象，减少错误折叠的可能，并使折叠后的蛋白处在最适的PH值下。特别对于含有二硫键的蛋白，酸性条件下，可以避免此时二硫键的形成，而蛋白不同部位的二硫键形成时的PH值得要求不同，从酸性到碱性的pH值得梯度变化，可以避免二硫键错配的可能，满足不同位置二硫键形成的要求。如果为了使蛋白的二硫键形成，直接使蛋白处在高碱性环境中，一些错配的二硫键不能重新交换重排，也会降低复性的效率。相对于变形的蛋白在溶液中的复兴过程，变性的蛋白肽链吸附在层析介质上折叠复性，可以避免蛋白多肽链之间由于折叠中间体的疏水相互作用形成聚集体。因为在溶液中复性，蛋白肽链是活动的，多肽链之间很容易相互接触形成聚集体。吸附在层析介质上，每个多肽链自主的折叠，很少发生之间的折叠而形成聚集体。所以吸附层析复性可以大大降低聚集体的形成。并且，在离子交换层析中，吸附的蛋白多肽链位点是亲水的位点，疏水位点处在溶液中折叠复性，不会干扰蛋白的折叠。本专利技术在高浓度的变性剂条件下(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纯化包涵体蛋白的方法，其特征在于，该方法为将溶解的包涵体蛋白在离子交换层析柱中进行变性剂浓度的梯度洗脱或pH值的梯度洗脱或同时进行变性剂的浓度梯度洗脱及pH值的梯度洗脱；其具体步骤是：1)酸性/碱性流动相I或者其它溶液溶解的包涵体蛋白进经流动相I平衡后的离子交换层析柱，包涵体蛋白可逆地被吸附在层析介质上；2)然后用酸性/碱性流动相II梯度取代酸性/碱性流动相I对包涵体蛋白溶液进行梯度洗脱，洗脱梯度长度为1？5个的柱体积，流动相II中的变性剂的浓度低于流动相I中变性剂的浓度；所述的变性剂为脲、Triton或Tween；在流动相I中的浓度为6～10mol/L；在流动相II中的浓度为0.5～3mol/L；所述的流动相I为酸性缓冲液，pH为3～7；流动相II为碱性缓冲液，pH为8～11。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈放，李如伟，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：