本发明专利技术提供鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗及其制备方法，涉及生物工程领域。所述二联灭活疫苗，含有鸡新城疫病毒LaSota株和禽流感病毒A/chicken/HeNan/03/2009/(H9N2)株。制备所述疫苗的方法：病毒液的制备、浓缩与灭活，水相制备，油相制备，乳化，即得二联灭活疫苗。本发明专利技术鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗，免疫原性好，产生的抗体水平高，不仅能够抵抗同源病毒攻毒，而且能够抵抗2011年以来新流行的H9N2亚型禽流感病毒SH01、H9N2亚型禽流感病毒JX02攻毒；该二联灭活疫苗能够产生高水平的抗体，持续期长；其制备方法简单，安全。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程领域，具体涉及一种鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗及其制备方法。
技术介绍
新城疫又称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟，具有很高的发病率和病死率，是危害养禽业的一种主要传染病，OIE将其列为A类疫病。新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)引起的禽的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病，以高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血为特征。该病死亡率高，对养鸡业危 害严重。1926年首先发现于印度尼西亚，不久又在英国新城发现，世界各国均有流行记载。 禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)隶属于正粘病毒科A型流感病毒属，因为该病毒是AIV负链、分节段的RNA病毒，所以该病毒很容易发生变异并不断的突破其感染宿主的种属障碍，引起新的流感流行。自1966年首次在北美的火鸡体内分离到H9N2亚型AIV以来，该亚型的病毒不断传播，目前已在全世界范围的禽群中广泛存在。我国也于1992年首次报道了鸡群中H9N2亚型AIV的感染，H9N2亚型是目前我国鸡群中存在的AIV主要亚型，占禽流感总发病率的90%以上。H9N2亚型禽流感发病后虽然致死率不高(一般不超过30%),但常导致呼吸道症状，蛋鸡的产蛋下降，并使鸡群易继发严重的呼吸道疾病，影响家禽生产性能。AIV不仅对我国的养殖业造成了严重的损失，而且对人类健康也构成了威胁。目前新城疫、H9N2亚型禽流感严重危害家禽养殖业的发展，在各种防控措施中，疫苗的免疫仍为最重要的措施。针对新城疫、H9N2亚型禽流感，已有相应的灭活单苗及二联灭活苗，但是免疫剂量大，抗体水平低，对流行毒株的交叉免疫保护率不高，给免疫鸡群带来一定的风险。因此，研制出免疫剂量小，交叉免疫效果更好的新城疫、禽流感H9N2亚型二联苗是一项具有重要意义的工作。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗，该二联灭活疫苗中含有的H9亚型禽流感病毒HN03株，免疫原性好，产生的抗体水平高，不仅能够抵抗同源病毒攻毒，而且能够抵抗2011年以来新流行的H9N2亚型禽流感病毒SH01、H9N2亚型禽流感病毒JX02攻毒；该二联灭活疫苗能够产生高水平的抗体，持续期长。本专利技术的另一目的在于提供鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗的制备方法，该方法简单，安全。本专利技术采用如下技术方法来实现专利技术目的 一种鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗，含有鸡新城疫病毒La Sota株和禽流感病毒 A/chicken/He Nan/03/2009/ (H9N2)株；所述禽流感病毒 A/chicken/HeNan/03/2009/ (H9N2)株缩写为H9N2亚型禽流感病毒HN03株，保藏号为CGMCC NO :6258。所述鸡新城疫病毒La Sota株和H9N2亚型禽流感病毒HN03株的含量比为2: I 30一种制备所述鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗，包括如下步骤 Cl)病毒液的制备将鸡新城疫病毒La Sota株和H9N2亚型禽流感病毒HN03株分别接种SPF鸡胚，分别收获鸡胚液，作为鸡新城疫病毒La Sota株病毒液和H9N2亚型禽流感病毒HN03株病毒液； (2)病毒液的浓缩与灭活将鸡新城疫病毒LaSota株病毒液和H9N2亚型禽流感病毒HN03株病毒液分别浓缩，然后分别加入丙内酯获得鸡新城疫病毒La Sota株灭活病毒液和Η9Ν2亚型禽流感病毒ΗΝ03株灭活病毒液； (3)水相制备将鸡新城疫病毒LaSota株灭活病毒液和Η9Ν2亚型禽流感病毒ΗΝ03株灭活病毒液混合，获得混合病毒液；将混合病毒液与吐温-80混合，制得水相； (4)油相制备将注射用白油和司本一80混匀，作为油相； (5)乳化将水相和油相混合均匀，即得鸡新城疫和Η9Ν2亚型禽流感二联灭活疫苗。步骤(2)中，所述鸡新城疫病毒La Sota株病毒液浓缩至每O. I晕升浓缩后鸡新城疫病毒液中病毒含量为3X108_° EID5tl 3Χ IO9 tlEID5tl ;所述Η9Ν2亚型禽流感病毒HNO3株病毒液浓缩至每O. I晕升浓缩后禽流感Η9病毒液中病毒含量为3Χ IO8'0 EID50 3 XlO8- 5EID500所述步骤(2)中各灭活病毒液中β -丙内酯的体积百分数为O. 04% O. 06%。步骤(3)中所述混合病毒液中鸡新城疫病毒La Sota株灭活病毒液与Η9Ν2亚型禽流感病毒ΗΝ03株灭活病毒液的体积比为2:1 3 ;步骤(3)中所述混合病毒液与吐温_80混合的体积比为96 4。步骤(4)中所述注射用白油和司本一 80混合的体积比为94 6。步骤(5)所述水相和油相混合的体积比为1:3。有益效果 本专利技术鸡新城疫和Η9Ν2亚型禽流感二联灭活疫苗中含有的Η9亚型禽流感病毒ΗΝ03株，是专利技术人自行分离、筛选、鉴定的，该毒株免疫原性好，产生的抗体水平高，不仅能够抵抗同源病毒攻毒，而且能够抵抗2011年以来新流行的Η9Ν2亚型禽流感病毒SHOl、Η9Ν2亚型禽流感病毒JX02攻毒；该二联灭活疫苗能够使接种对象产生高水平的抗体，持续期长，不仅能够抵抗Η9Ν2亚型禽流感病毒JX02攻毒，而且能够抵抗2011年以来新流行的Η9Ν2亚型禽流感病毒SH01、Η9Ν2亚型禽流感病毒JX02攻毒。本专利技术制备鸡新城疫和Η9Ν2亚型禽流感二联灭活疫苗的方法，简单，安全。因为制备方法中对病毒液进行了浓缩，所以提高单位体积疫苗中的抗原含量，有效降低了使用剂量，成年鸡由原来免疫剂量O. 5ml/羽降到O. 3ml/羽，达到同样的免疫效果；使用了使用了丙内酯作为灭活剂，使产品中不含甲醛，确保受免动物体内无甲醛残留，提高畜产品的品质。具体实施例方式实例I Η9Ν2亚型禽流感病毒ΗΝ03株的分离与鉴定 I.病料 病料为无菌采集死亡病鸡的心血、肝、脑、肺组织。2.组织触片 将病料作心血涂片及各脏器的病毒组织触片，并进行染色镜检，发现病毒组织触片染色镜检结果为阴性。3.细菌培养 将上述病料，分别用马丁肉汤和绵羊血培养基培养(按现行《中国兽药典》附录方法配制)，结果显示无菌落生长，说明所述病料中不含有细菌。4.病料处理 将上述病料在无菌容器中剪碎、磨碎，用含青链霉素的灭菌生理盐水(每毫升生理盐水含2000单位的青霉素和2000单位的链霉素)作I : 5倍稀释，反复冻融三次后，3000r/min离心20分钟，取上清液保存于_20°C备用。 5.病毒分离、接种及收获 将本实施例标题4中获得的上清液，尿囊腔途径接种10日龄SPF鸡胚，每胚接种量O.2ml，接种后置37°C条件孵化。接种24小时以内死亡胚弃去，收获24小时以后死亡鸡胚尿囊液，测定尿囊液红细胞凝集价，将红细胞凝集价不低于I : 64的尿囊液置-20°C保存，为鸡胚扩繁的第一代种毒，简称El代种毒。将El代种毒继续传3代，即为E4代种毒，用于病毒生物学特性鉴定。红细胞凝集价采用红细胞凝集试验(微量法)进行检测，具体方法如下在96孔(角度为110° )微量板上，从第I孔至12孔，每孔加入生理盐水30 μ 1，用加液器吸取含毒尿囊液30 μ 1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗，其特征在于：含有鸡新城疫病毒La？Sota株和禽流感病毒A/chicken/He？Nan/03/2009/(H9N2)株；所述禽流感病毒A/chicken/He？Nan/03/2009/(H9N2)株缩写为H9N2亚型禽流感病毒HN03株，保藏号为CGMCC？NO：6258。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：于漾，揭鸿英，朱亚露，何家惠，邓碧华，张小飞，艾玉春，刘志凌，顾巍巍，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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