本发明专利技术是基于脐带血(CB)和成人骨髓(BM)CD34+细胞可以重编程为早期干细胞的开创性发现。本发明专利技术提供了对来源于主体的CB和成人骨髓(BM)CD34+细胞的重编程，且无需任何预处理。提供了重编程主体血细胞的方法。也提供了建立疾病模型方法和产生主体特异性分化细胞的方法。另外，本发明专利技术提供的方法可用于识别试剂，所述试剂能改变主体特异性的分化细胞的功能，以及改变由血细胞重编程获得的分离的多潜能或多功能干细胞的功能。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】血细胞重编程产生多潜能干细胞和多功能干细胞专利技术背景专利
本专利技术总体涉及干细胞领域，更具体地，涉及将血细胞重编程为多潜能(pluripotent)和多功能(multipotent)干细胞。背景信息近年来衍生出了源自患者体细胞的人类的诱导多潜能干(iPS)细胞，其有望产生患者和疾病特异性的干细胞系，用于开发新的细胞疗法和建立疾病模型。这些人类iPS细胞展示出与人类胚胎干(hES)细胞相似的特征，包括在培养基中无限制扩增。大部分公布的方案使用载体递送多种编码转录因子的转基因，例如0CT4、S0X2、KLF4和c_MYC，用于重编程贴壁细胞，例如皮肤和毛发的成纤维细胞和角蛋白细胞。 非常期望对血细胞进行重编程，因其易于获得，且较少暴露于环境的诱变剂中。例如，可使用在多个细胞库中收集和贮存的脐带血(CB)细胞，作为自体同源或异源的但组织相容的iPS细胞系的来源。更关键的是，如果希望产生的iPS细胞含有的体细胞突变仅限于血细胞且存在于获得性血液疾病中，从而以研究这些疾病的机制，那么重编程血细胞的能力就至关重要。之前的研究证明，分化的小鼠B细胞可以重编程为iPS细胞，这主要是通过使用转基因(重编程就绪)小鼠完成，其带有在一定条件下有活性的四种重编程转基因。更近地，由单个同种造血干细胞在小鼠中重建了造血作用，用从这样的小鼠中得到的骨髓祖细胞衍生出了小鼠iPS细胞系，这进一步证明了小鼠造血细胞可以重编程为具有多潜能性。此前一直没有报道过出生后的人类血细胞衍生为iPS细胞，直到最近，报道称粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员的健康人外周血(PB)CD34+细胞可以被重编程为iPS细胞。但是，并不清楚通过每天的G-CSF治疗能否影响重编程过程，或由血细胞衍生的iPS细胞的性质。因此，仍然需要由体细胞，特别是血细胞或脐带血细胞，有效地生成诱导的多潜能干细胞。专利技术概述本专利技术是基于脐带血(CB)和成人骨髓(BM)CD34+细胞可以重编程为早期干细胞的开创性发现。本专利技术提供了来源于对主体的CB和成人骨髓(BM)CD34+细胞的重编程，且无需任何预处理。提供了重编程主体血细胞的方法。也提供了建立疾病模型方法和产生主体特异性分化细胞的方法。另外，本专利技术提供的方法可用于识别试剂，所述试剂能改变主体特异性的分化细胞的功能，以及改变由血细胞重编程获得的分离的多潜能或多功能干细胞的功能。在一个实施例中，本专利技术涉及一种产生多潜能或多功能干细胞的方法。所述方法包括向培养基中的血细胞引入含有至少一种多潜能因子的非病毒载体，从而将血细胞重编程为多潜能或多功能干细胞。在一方面，载体包括多个多潜能基因。在另一方面，本专利技术的方法进一步包括向培养基中加入至少一种皮质类固醇。在另一方面，所述至少一种皮质类固醇选自下组醛固酮、倍氯米松、倍他米松、可的松、去氧皮质酮、地塞米松、氟氢可的松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙、泼尼松、以及曲安西龙。在另一方面，所述至少一种皮质类固醇为地塞米松。在另一方面，本专利技术的方法进一步包括向培养基中加入至少一种细胞因子。在另一方面，所述至少一种细胞因子选自下组睾丸支持细胞因子(SCF)、Fms相关酪氨酸激酶3配体(FLT3或FL)、促血小板生成素(TPO)、促红细胞生成素(EPO)、以及白介素3 (IL-3)。在另一方面，所述血细胞为脐带血(CB)细胞、成人骨髓(BM)CD34+细胞、成人外周血(PB)细胞、成人外周血(PB)CD34+细胞、成人外周血(PB)CD34+CD45+细胞、或成人外周血单核细胞(PBMC)。在另一方面，所述主体为哺乳动物。在另一方面，所述主体为人类。在另一方面，所述多潜能或多功能干细胞包括造血干细胞。在另一方面，所述主体有骨髓增殖性疾病(MPD)。在另一方面，所述至少一种多功能因子包括至少三种因子，所述因子选自下组S0X2、S0X7、S0X17、0CT4、Nanog, LIN28、c_Myc、KLF4、ESRRB, EBF1、C/EBPa、C/EBP β 、NGN3、PDX以及MAFA，或其活性片段。在另一方面，所述至少一种因子包括0CT4、S0X2、KLF4、以及c-MYC,或其活性片段。在另一方面，所述至少一种因子包括0CT4、S0X2、KLF4、MYC、LIN28、以及SV40T抗原，或其活性片段。在一方面，所述非病毒载体为游离型载体。在另一方面，所述方法进一步包括向血细胞中引入第二个游离型载体。在另一方面，第二个游离型载体表达SV40T抗原(Tg)。在另一方面，第一个游离型载体包括多个多潜能基因，所述多潜能基因与至少一个调控序列操作性(operatively)连接以表达所述因子。在另一方面，所述游离型载体为oriP/EBNAl质粒。在另一方面，PBMC来自镰状细胞性贫血患者。在另一方面，PBMC包括S⑶B003细胞。在另一实施例中，本专利技术涉及一种确定对主体细胞有疗效的试剂的方法。所述方法包括使测试试剂接触上述任意方法生成的多潜能或多功能干细胞，并检测测试试剂存在与不存在时功能的变化。在另一实施例中，本专利技术涉及一种生成分化细胞的方法，所述方法包括诱导上述任意方法生成的多潜能或多功能干细胞的分化，从而获得分化细胞群。在一方面，所述分化细胞包括血细胞、肌细胞、神经元细胞、结缔组织、心肌细胞、巨核细胞、内皮细胞、肝细胞、成肾细胞、成脂细胞、成骨细胞、破骨细胞、肺泡细胞、心脏细胞、肠细胞、肾细胞、视网膜细胞或上皮细胞。在另一方面，所述分化细胞包括胰腺β细胞、肝细胞、心肌细胞或骨骼肌细胞。在另一实施例中，本专利技术涉及上述任意方法产生的分离的多潜能或多功能干细胞的富集细胞群。在一方面，所述分离的多潜能或多功能干细胞表达一种选自下组的细胞表面标记SSEAl、SSEA3、SSEA4、TRA-l-60、以及 TRA-1-81。在另一实施例中，本专利技术涉及一种治疗需要更换或更新细胞的疾病。所述方法包括给予主体有效量的由上述任意方法生成的多潜能或多功能干细胞。在另一实施例中，本专利技术涉及重编程的非病毒游离型载体。在一方面，所述非病毒游离型载体包括至少五个多潜能基因，其与至少一个调控序列操作性连接，以表达至少五种多潜能因子。在另一方面，所述载体为oriP/EBNAl质粒。附图简述图I显示了由CB衍生的未分化iPS细胞(U)和在体内分化之后得到的畸胎瘤细胞⑴中，未分化(0CT4和NANOG)和分化标记物的基因表达。可以用RT-PCR分析测定甲胎蛋白(AFP，内胚层)、CD34(中胚层)和PAX6(外胚层)和管家基因GAPDH的表达。图2显示了由PV iPS细胞生成的造血祖细胞的红系分化增加。为了评估红系分化潜能，在液体培养基(图2A和2C)或含有血清和甲基纤维素的培养基(图2B和2D)中铺板纯化的⑶34+⑶45+细胞，所述细胞来源于正常对照(NC)，或经胚状体介导的造血分化之后的PV iPS细胞。图2A显示了来源于NC(13.5 ±3.6倍)或PV iPS细胞(27·6±3·3倍)的纯化的⑶34+⑶45+细胞在液体中培养7天之后的细胞扩增倍数。图2Β显示了⑶34+⑶45+细胞在甲基纤维素中培养14天之后的细胞扩增倍数，NC为69. 5±24. 7倍，PV iPS细胞为127±28. 3倍。图2A和2B的数据用平均本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：程临钊，
申请(专利权)人：程临钊，
类型：发明
国别省市：
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