本公开涉及对受体细胞(优选人体细胞)去分化和转分化的方法。这些方法将非所需基因组序列变异的风险降到最低。这些方法采用可单独使用或相互以某些组合方式使用的重编程因子。这些方法尤其应用于基于细胞的治疗、建立细胞系和产生基因修饰细胞的情况。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开涉及对受体细胞或受体细胞核(优选人体细胞或人体细胞核)重编程(去分化和转分化)的方法和材料。这些方法尤其应用于基于细胞的治疗、组织移植、建立细胞系和产生基因修饰细胞和嵌合体动物或转基因动物的情况。 另一方面，本公开涉及“去分化”和/或改变所需受体细胞(优选人体细胞)寿命的方法。这些方法尤其应用于基于细胞的治疗和产生基因修饰细胞的情况。另一方面，本公开涉及实现体细胞转分化的方法。转分化是将细胞由一种分化细胞类型转化为另一种分化细胞类型。另一方面，本公开通常涉及将动物体细胞由一种特定分化状态重编程为另一种状态的方法，和这种细胞和组织在治疗人疾病和年龄相关病状中的用途。更具体地讲，本公开涉及利用三步法的改进方法，由此首先将体细胞核的核被膜重塑为未分化细胞或生殖谱系细胞的核被膜，然后第二步将重塑的细胞核转移至卵母细胞或未分化细胞的细胞质中。该核重塑步骤明显提高了重塑细胞核转移至胚胎或生殖谱系细胞质内以便干细胞衍生时的细胞重建效率。另外，去除对分化细胞有特异性的核被膜组分(例如核纤层蛋白A)和重编程染色质导致端粒酶活性再激活，加长端粒长度和修复串联重复DNA序列的同源重组机制。当通过这些方法得到多能干细胞时，多能干细胞可用于治疗心脏、神经、内分泌、血管、视网膜、皮肤、肌肉骨骼病症和其它疾病的新型治疗策略中。2.相关技术描述干细胞技术的进展，例如人胚胎干(hES)细胞的分离和使用，已成为医学研究中的新的重要主题。hES细胞具有经证实分化为人体各种细胞类型(包括复合组织)的潜能。hES细胞的这种能力表明由细胞功能异常引起的许多疾病可通过施用各种分化类型的hES源细胞来进行治疗(Thomson 等，Science. 1998 年 11 月 6 日；282(5391) :1145-7)。核移植研究证明了可将分化的体细胞转化回全能状态，例如ES或ED细胞的全能状态(Cibelli等，Nat Biotechnol. 1998年7月；16(7) :642-6)。通过核移植将体细胞重编程回全能ES细胞状态的技术发展提供了一种递送具有患者核基因型的ES源体细胞的方法(Lanza等，Nat Med. 1999年9月；5(9) :975-7)。尽管存在同种异体线粒体，但期望此类细胞和组织不被排斥(Lanza等，Nat Biotechnol. 2002年7月；20(7) =689-96) 核移植还允许通过再激活早期胚胎中端粒酶催化组分来改造细胞中的端粒重复长度(Lanza等,Science. 2000年4月 28 日；288(5466) :665-9)。由于获得足够数量的人卵母细胞相对困难，人们对确定其它生殖谱系细胞，例如培养的ES细胞或来自所述细胞的细胞质是否可用于重编程体细胞产生了极大兴趣。由于这种细胞可易于在数量上体外扩增，所以在作为诱导重编程的方式上优于卵母细胞很多。与ES细胞融合后，在体细胞中观察到至少一些测量的胚胎特异性基因的表达恢复(Do和 Scholer, Stem Cells. 2004 ；22 (6) :941-9 ；Do 和 Scholer, Reprod Fertil Dev. 2005 ；17(1-2) :143-9)。然而，所得到的细胞为杂种且通常具有四倍体基因型，因此不适合作为用于移植的正常或组织相容性细胞。实际上，提出的生成自体全能细胞的一个目的是为了防止排斥ES源细胞。使用这些公开研究中描述的技术，因此用于重编程患者细胞的ES细胞很可能增加可产生导致排斥的免疫反应的等位基因。尽管如此，ES细胞可重编程体细胞 染色体的证据令研究者兴奋并且形成了称为“融合生物学”的新研究领域(Dennis，Nature426 :490-491, (2003))。然而，ES细胞研究受到围绕使用非期望IVF胚胎生成ES细胞和并不打算用于受精和妊娠而用于替代性方法以生成患者免疫相容细胞供再生医学应用的捐赠卵母细胞的争论的阻碍。目前许多国家对胚胎干细胞研究加以限制，包括对可用国家基金的限制以及对卵母细胞和胚胎使用的严格方针，从而导致该领域进展缓慢。而且，基于ES细胞治疗的临床有用性将受限制，除非可用不同组织相容性细胞来匹配个体患者。能够重编程比人卵母细胞更具可用性的人体细胞的另一潜在细胞来源为动物物种的卵母细胞。可通过跨物种核移植恢复体细胞全能性的证实(Lanza等，Cloning. 2000 ；2(2) :79-90)为鉴定可易于获得用于重编程人细胞的动物卵母细胞开创了可能性(Byrne等，Curr Biol. 2003年7月15日；13(14) :1206-13)。然而，尽管跨物种核移植是可能的，但其通常比同物种核移植效率更低，这可能是由于物种间的分子差异。因此，各种重编程人体细胞的方法均存在困难。SCNT提供了令人满意的重编程水平，但受到研究者可用的人卵母细胞数量的限制。跨物种核移植和细胞融合技术通常不受用于重编程的细胞限制，但受成功重编程程度或所得到的重编程细胞的生长强度限制。使用供体细胞的细胞质进行去分化的替代方案是引入限定因子。为鉴定一组可使用的去分化因子，Takahashi和Yamanaka(2006年8月25日；126(4) :663-76)通过逆转录病毒转导将候选基因引入小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。每个逆转录病毒载有单个候选基因，并且候选基因的组合通过多次感染引入。还对MEF进行工程改造，以在ES细胞特异性Fbxl5启动子的控制下表达选择性标记，使得在抗生素G418存在下的细胞存活依赖于成功去分 化。通过测试不同因子的组合，作者证实4种转录因子基因(0ct4、SOX2、c-Myc和Klf4)的组合产生称为诱导的多能(iPS)细胞的ES样多能细胞。Yu等使用类似方法(Science. 2007年 12 月 21 日；318(5858) :1917-20)、通过病毒整合编码 0ct4、Sox2、Nanog 和 Lin28 的基因生成人iPS细胞。虽然逆转录病毒转染是同时将多个基因递送至体细胞内的有效方法，但将其用于去分化出现安全忧虑。因为这些方法导致多个基因在多个位点整合，难以使用切除转基因(例如，Cre-Lox和FLP-FRT)的靶向技术，因为可能导致非期望的缺失和其它染色体内和染色体间基因组重排。而且，插入逆转录病毒载体可能威胁转染的细胞基因组的完整性，(例如)通过影响非靶向基因，通过整合非所需病毒序列和通过异常表达导致恶性肿瘤的整合基因。实际上，再激活逆转录病毒携带的c-Myc导致在约50%由iPS细胞培育的嵌合体小鼠体内形成肿瘤(Okita 等，Nature. 2007 年 7 月 19 日；448(7151) :313-7)。 鉴于上述，需要安全有效的方法对细胞去分化或转分化。所需方法要避免使用胚胎或胚胎源物质，并且还要避免非所需的基因组序列变异。尤其是需要提高重编程分化体细胞和生成重编程细胞的频率和质量的方法，所述重编程细胞能够体外扩增以获得可用数量的细胞进行研究、测试以便质量控制和用于基于细胞的治疗。优选地，这些方法提供了用于治疗的患者来源的细胞的可行来源。专利技术概述申请人:描述了用于对体细胞(优选人体细胞)重编程或转分化的方法和材料，所述体细胞可任选地经基因修饰，使本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：I·克利曼斯卡雅，SJ·陆，R·兰扎，
申请(专利权)人：先进细胞技术公司，
类型：发明
国别省市：
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