本发明专利技术公开一种在一张芯片上同时检测多种真菌毒素(黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素M1、呕吐毒素、赭曲霉毒素A、T-2毒素、玉米赤霉烯酮)的免疫芯片制备方法及其检测技术。将各毒素完全抗原点制于芯片上，使其以扩散方式进入活化醛基的琼脂糖聚合物层，共价偶联于芯片表面。采用竞争法进行免疫芯片技术研究，即检测时将多种毒素的单抗及标准品混合后加到芯片上，使相应的待测物抗原与小分子竞争单抗，再加入Cy3标记的二抗，形成待测物抗原-单抗-二抗的复合物，荧光信号随小分子浓度的增加而减弱，从而达到检测目的。该技术灵敏度达pg～ng级，结果稳定可靠，且样品用量少，简便、快速，为多种毒素的检测提供新方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及了一种免疫芯片的制备方法，特别是涉及到一种检测多种真菌毒素的免疫芯片检测技术。
技术介绍
真菌毒素(Mycotoxin)是生物毒素中的一种，是丝状的小型真菌(这些真菌对动物和人类的疾病构成严重威胁)产生的次级代谢产物。目前，已知有350多种不同的真菌毒素。通常，真菌毒素污染粮食作物和动物饲料，进而污染肉、蛋、奶等动物性食品，进入人类生物链，不仅可导致农产品霉败变质、营养成分损失以及产品品质的降低，还可通过对人和动物机体内DNA、RNA、蛋白质和各种酶类的合成抑制以及对细胞结构的破坏而造成致畸、致突变和致癌等严重危害。因此，在全球环境与食品安全问题中备受关注。随着国际国内对食品安全重视程度的日益加强，并鉴于真菌毒素所带来的危害， 在农产品与食品安全指标中，真菌毒素的含量已经成为重要的检测指标。国内外研究主要集中在农产品及饲料中常见的、对人类危害较大的十几种真菌毒素上，它们一般同时具有毒性强和污染频率高等特点。根据此，本专利技术所研究的靶标物为六种真菌毒素，包括黄曲霉毒素BI (Aflatoxin BI, AFB1)，它被公认为是致癌性和毒性最强的毒素，靶器官是肝脏，可抑制动物生长、致畸等；黄曲霉毒素Ml (Aflatoxin Ml, AFM1)，其毒性主要表现为致癌、致突变性等；呕吐毒素，又名脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)，具有很强的细胞毒性，抑制蛋白质的合成，还可引起生殖发育毒性、免疫毒性、致癌性等；赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，0TA)，其靶器官为肾脏，表现在肾小管变性和机能损伤，致癌致畸等；T_2毒素(T-2 toxin，T-2)，它可抑制蛋白质、DNA的合成，强免疫毒性，致癌致畸，有致死作用和对皮肤细胞以及遗传的毒性；玉米赤霉烯酮，又名F-2毒素(Zearalenon^ZEN)主要作用于生殖系统，可引起人畜发生雌激素亢进症，具有较强生殖毒性和致畸作用等。目前，国内外检测真菌毒素最常用的方法是高效液相色谱法(HPLC)和酶联免疫吸附法(ELISA)，前者检测灵敏度高，但样品前处理繁琐、操作复杂、时间长，所需设备较昂贵；后者操作简便、快速，但每次只能完成一种真菌毒素的检测，对于多种毒素的检测费时、费力，工作量巨大。免疫芯片(Immunochip)是蛋白质芯片中的一种，由固定于不同支持介质上的抗原或抗体微阵列组成，阵列中固定分子的位置及组成是已知的，用相应的抗体或抗原与芯片上的探针进行反应，再将标记有荧光物质、酶或化学发光物等的二抗进行第二次反应，然后通过特定的扫描装置进行检测，提取扫描结果数据，并用Origin 8. 0软件对其进行处理分析，从而达到对待测物进行检测的目的。制备的多种真菌毒素检测的免疫芯片具有高通量、操作简便、重复性好、灵敏度高等优点，适用于对真菌毒素小分子化学污染物的快速定量检测，在环境与食品安全有毒有害物质的检测领域具有广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有检测方法存在的缺陷，提供一种操作简单、灵敏快速的六种真菌毒素的免疫芯片检测技术。本专利技术的另一个目的是提供了同时检测六种真菌毒素时免疫芯片的制备方法。本专利技术的技术方案概述如下(I)确定六种真菌毒素抗原的最佳工作浓度。(2)确定六种真菌毒素抗体的最佳工作浓度及抗原抗体特异性的检测。(3)同时检测六种真菌毒素标准曲线的绘制。(4)待测样品中多种真菌毒素的测定。 优选的是步骤(I)确定六种真菌毒素抗原的最佳工作浓度为将六种真菌毒素完全抗原的工作浓度各设定为六种不同的浓度梯度，并与三种对照同时点制于芯片上，制备此阶段的免疫芯片，通过扫描仪进行鉴定；再将所述的六种真菌毒素的鼠源单克隆抗体进行竞争结合免疫反应，得到六种真菌毒素抗原的最佳工作浓度以及抗体较优的工作浓度，为下步确定六种真菌毒素抗体的最佳工作浓度做准备。所述步骤(2)确定六种真菌毒素抗体的最佳工作浓度及抗原抗体特异性的检测为先配制六种真菌毒素抗原的最佳工作浓度溶液，与三种对照液同时点制于芯片上，制备此阶段的免疫芯片，通过扫描仪进行鉴定；再将所述的六种真菌毒素抗体较优的工作浓度溶液(各四个浓度梯度)进行免疫反应，得到六种真菌毒素抗体的最佳工作浓度，为下步同时检测六种真菌毒素时标准曲线的绘制做准备。并且，结合步骤(I)得出的结果，对六种真菌毒素抗原抗体的特异性进行分析。所述步骤(3)同时检测六种真菌毒素标准曲线的绘制为先配制六种真菌毒素抗原的最佳工作浓度溶液，与三种对照液同时点制于芯片上，制备此阶段的免疫芯片，通过扫描仪进行鉴定；再将所述的六种真菌毒素抗体最佳的工作浓度溶液进行竞争结合免疫反应，得到在一张芯片上同时检测六种真菌毒素的标准曲线，为下步待测样品中多种真菌毒素的测定做准备。所述步骤(4)待测样品中多种真菌毒素的测定为先配制六种真菌毒素抗原的最佳工作浓度溶液，与三种对照液同时点制于芯片上，制备此阶段的免疫芯片，通过扫描仪进行鉴定；再将所述的六种真菌毒素抗体最佳的工作浓度溶液进行竞争结合免疫反应，得到在在一张芯片上对自来水中六种真菌毒素进行加标检测。通过一系列的优化实验，本专利技术可以简便、有效地检测水中六种真菌毒素的加标含量，灵敏度可达Pg ng级，检测区间为2 3个数量级，结果与实际值相比偏差较小。附图说明图I为每张芯片的布局图和亚阵列的设计。其中，A图为琼脂糖修饰后的芯片布局图，每张芯片含有12个独立的亚阵列；B图为第一阶段工作即确定六种真菌毒素抗原最佳浓度时各探针的设计图，探针主要包括六种真菌毒素完全抗原(AFT-BSA，AFM1-BSA, DON-BSA, OTA-OVA, T-2-BSA，ZEN-BSA)工作溶液和三种对照工作液(Cy3-BSA，Blank, mouse-IgG) ;C图为后三个阶段工作时各探针的设计图，此时探针为六种真菌毒素完全抗原的最佳浓度工作液和三种对照工作液，各毒素抗原的最佳工作浓度依次为AFT-BSA 0. 2mg/mL、AFMl-BSA 0. lmg/mL、DON-BSA 2. Omg/mL、OTA-OVA 2. Omg/mL、T-2-BSA 0. 2mg/mL、ZEN-BSA I. Omg/mL。图2为免疫芯片检测技术的操作流程。图3为优化六种真菌毒素抗原的最佳浓度结果。其中，3-1A(AFT)、3-2A (AFMl)、3-3A (DON)、3-4A (OTA)、3-5A (T-2)、3-6A (ZEN)分别为六种真菌毒素六种不同浓度的抗体工作液与各探针杂交后扫描图；3_1B(AFT)、3-2B(AFMl)、3-5B(T-2)图分别为六种不同浓度的抗体与对应的抗原杂交曲线图。图4为优化六种真菌毒素抗体的最佳浓度结果。 其中，4-IA(AFT)、4-2A (AFMl) 4-3A (DON)、4_4A (OTA)、4_5A (T_2)、4_6A (ZEN)是各真菌毒素四种不同浓度的且较优的抗体工作液杂交后扫描图。对应地，4_1B(AFT)、4-2B(AFMl)、4-3B(D0N)、4_4B(0TA)、4_5B(T_2)、4_6B(ZEN)是各抗原抗体杂交曲线图。图5为六种真菌毒素抗原抗体的特异性检测结果。图6为免疫芯片法同时检测六种真菌毒素标准曲线的绘制。其中，A图是免疫芯本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种多真菌毒素定量检测的免疫芯片，由3D活化醛基琼脂糖芯片和阵列式点制于芯片上的蛋白检测指标及各种对照指标组成。其特征在于，所述的芯片表面上的蛋白检测指标包括：黄曲霉毒素总量、黄曲霉毒素M1、呕吐毒素、赭曲霉毒素A、T？2毒素、玉米赤霉烯酮共六种真菌毒素的完全抗原，通过活化共价偶联于芯片表面。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：高志贤，王莹，刘楠，柳明，宁保安，李君文，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所，
类型：发明
国别省市：
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