本发明专利技术公开了一种快速检测皮革真实属性的试剂盒及其检测方法，所述试剂盒包括DNA提取缓冲液、Taq?DNA聚合酶、PCR反应液、上样缓冲液。本发明专利技术从遗传学角度对皮革样品基因成分进行分析鉴别，克服了传统的感官鉴别方法所面临的难题，具有特异性强、灵敏度高、方法重现性好、检测快速简便等优点，弥补了当前皮革基因检测方法的空白，为皮革种类的鉴定提供了一种精确且易于标准化的分析方法，为质量监督等提供了技术支持，可广泛应用于皮革包括毛皮等样品基因的提取、皮革品种鉴定等方面，具有良好的经济社会效益与重大的推广应用价值，对于有效监管皮革产品质量，保护广大消费者利益具有重大意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种。
技术介绍
PCR是聚合酶链式反应的简称，是分子生物学中广泛运用的一项技术，主要原理是通过热循环，达到目的基因片段的大量扩增。目前这项技术越来越广泛地运用于产品检测之中。例如，运用PCR技术检测牛奶或腊肠中的植物成分 等，运用PCR技术检测肉骨粉等产品中的动物源性成分等，运用PCR技术检测食品中的转基因成分等。皮革主要是由哺乳类动物毛皮加工而成，是我国重要的出口创汇产品。天然皮革按其动物来源种类分，主要有牛皮革、羊皮革、猪皮革、马皮革、兔皮革等。由于天然皮革种类繁多，价格昂贵，一些不法商贩为了寻求利益的最大化，以人造革冒充天然皮革，或以低档皮革冒充高档皮革，损害了广大消费者的健康和利益，对社会经济以及皮革产业发展产生了不利的影响。目前，国内外皮革材质的鉴别主要仍以手摸眼看的感官鉴定方法为主，随着皮革加工技术的提高，在某些方面，感官鉴别方法已很难鉴别出皮革种类，急需开发更为科学有效的方法。
技术实现思路
基于此，本专利技术提供了一种快速检测皮革真实属性的试剂盒及其检测方法。该试剂盒主要是依据不同种类皮革所承载的遗传信息存在差异，通过基因检测技术特异性地分析皮革样品中的DNA信息来区分皮革种类。一种快速检测皮革真实属性的试剂盒，包括(I) DNA提取缓冲液所述DNA提取缓冲液的组成为15 25mg/L十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)、90 110nmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、15 25mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA2Na)、I. 3 I. 5mol/L 氯化钠(NaCl)、0· 09 O. 12g/L 蛋白酶 Κ，0· 9 I. lmol/L 二硫苏糖醇(DTT)；(2) Taq DNA聚合酶，所述Taq DNA聚合酶的浓度为125IU ；(3) PCR 反应液所述PCR反应液的组成为2. 7 3. 3mmol/L氯化镁，O. 3 O. 5 μ mol/L引物，O.3 O. 5mmol/L的三磷酸脱氧核苷酸；所述引物为针对动物源性基因序列的通用引物SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2 ；(4)上样缓冲液所述上样缓冲液的组成为'2. O 3. Og/L溴酚蓝、350 450g/L蔗糖。在其中一些实施例中，所述引物还包括针对牛、羊、猪、马或兔的线粒体基因序列的引物。在其中一个实施例中，所述针对牛线粒体基因序列的引物为SEQ ID NO :3和SEQID NO :4。在其中一个实施例中，所述针对羊线粒体基因序列的引物为SEQ ID NO :5和SEQID NO :6。在其中一个实施例中，所述针对猪线粒体基因序列的引物为SEQ ID NO :7和SEQID NO :8。在其中一个实施例中，所述针对马线粒体基因序列的引物为SEQ ID NO :9和SEQID NO 10o在其中一个实施例中，所述针对兔线粒体基因序列的引物为SEQ ID NO 11和SEQID NO 12ο 一种快速检测皮革真实属性的方法，采用上述试剂盒，包括以下步骤(I)制备样品DNA剪取50cm2左右的经酒精浸泡消毒后的皮革样品，放入碎皮机中破碎，使用磷酸盐缓冲溶液在不断振荡的条件下浸泡皮革样品12 16小时，期间每隔2 3小时换一次溶液，以降低皮革试样中的盐离子如铬离子等的含量；浸泡后将皮革样品再次破碎，取3mL破碎的样品，加入2mL DNA提取缓冲液，混匀。将离心管置于65°C放置45 60min，不时摇动，使样品充分裂解；取出，加入ImL饱和氯化钠溶液，剧烈振荡3 5min，置于(TC下放置5 lOmin，离心；取上清，用体积比为25 : 24 : I的苯酚氯仿异戊醇混合液进行提取，离心；取上清，用体积比为24 I的氯仿异戊醇混合液进行提取，离心；取上清，加入异丙醇沉淀核酸，_20°C放置2 4小时，使得异丙醇与核酸充分反应，高速离心，获得DNA沉淀；再用70%的乙醇溶液洗沉淀物，沉淀物加水溶解，即得样品DNA ；(2) PCR扩增反应取PCR反应液、Taq DNA聚合酶置于反应管中，混匀,加入样品DNA,离心后置于扩增仪上进行扩增，反应参数95°C预变性5min后，按94°C 30sec,55°C 45sec，72°C 60sec程序进行40个循环，最后72°C延伸lOmin，于4°C结束反应。(3)产物检测反应产物，加上样缓冲液，充分混匀后点样，用DNA Marker作为分子量标准，用含溴化己锭染色的I. 5%琼脂糖凝胶电泳，结束后，置紫外灯下观察，出现目标特异性条带的为含有某物种基因成分，否则为不含该物种基因成分。皮革制品一般经过浸灰、软化、浸酸、鞣制等过程，这些过程直接影响到DNA的完整性，特别是在皮革鞣制过程中，皮革样品中的DNA损失严重。此外，皮革样品基质复杂，含有多种PCR抑制因素，如盐离子、色素等。考虑到皮革样品的特殊性，本专利技术中的皮革DNA提取方法采用磷酸盐缓冲液与皮革材料充分混合的方式降低盐离子及色素对DNA提取的干扰，利用DNA提取缓冲液裂解皮革组织，释放核酸。用苯酚、氯仿、异戊醇混合溶液除去溶液中的蛋白，最后用异丙醇在低温条件下使DNA沉淀，获得纯化的皮革样品DNA。在获得较高质量的皮革样品DNA后，筛选特异性引物对所提取皮革中的基因组分进行分析检测。首先采用本专利技术开发的试剂盒检测皮革中的动物内源基因成分，检测到动物内源基因后，再根据设计好的特异性的物种专一性基因扩增引物，具体鉴别是牛、羊、猪、马还是兔等物种的基因序列，并进行测序验证实验结果。本专利技术针对皮革样品基质复杂，干扰因素多，且皮革样品中基因降解较为严重等问题，开发建立了高效的皮革DNA的提取方法，成功地从上百份不同类型的皮革样品中提取获得了较高质量的DNA。在改进并优化了从皮革样品DNA的提取到PCR检测一整个过程中的提取试剂与反应条件等关键控制性因素，开发建立了稳定性高、快速简便的一整套皮革真实属性的基因检测试剂盒。本专利技术从遗传学角度对皮革样品基因成分进行分析鉴别，克服了传统的感官鉴别方法所面临的难题，具有特异性强、灵敏度高、方法重现性好、检测快速简便等优点，弥补了当前皮革基因检测方法的空白，为皮革种类的鉴定提供了一种精确且易于标准化的分析方法，为质量监督等提供了技术支持，可广泛应用于皮革包括毛皮等样品基因的提取、皮革品种鉴定等方面，具有良好的经济社会效益与重大的推广应用价值，对于有效监管皮革产品质量，保护广大消费者利益具有重大意义。附图说明图I为实施例2的检测方法中所提取的部分皮革样品的DNA电泳图谱；其中，M DNA Marker ;泳道I 3 :提取的牛皮革样品DNA ;4 6 :提取的羊皮革样品DNA ;7 9 :提取的猪皮革样品DNA ；10 12 :提取的马皮革样品DNA ；13 16 :提取的兔皮革样品DNA ；图2为实施例2的皮革样品中动物内源基因检测的PCR产物电泳图谱；其中，M DNA Marker ；P :阳性对照(牛肉DNA，稀释至50ng/μ L) ；CK :阴性对照；泳道I 2 :提取的牛皮革样品DNA ；3 :提取的羊皮革样品DNA ；4 :提取的猪皮革样品DNA ；5 :提取的马皮革样品DNA ；6 :提取的兔皮革样品DNA ；图3为实施例2的牛皮本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速检测皮革真实属性的试剂盒，其特征在于，包括：(1)DNA提取缓冲液所述DNA提取缓冲液的组成为：15～25mg/L？CTAB、90～110nmol/L？Tris？HCl、15～25mmol/L？EDTA2Na、1.3～1.5mol/L？NaCl、0.09～0.12g/L蛋白酶K、0.9～1.1mol/L？DTT；(2)Taq？DNA聚合酶，所述Taq？DNA聚合酶的浓度为125IU；(3)PCR反应液所述PCR反应液的组成为：2.7～3.3mmol/L？MgCl2，0.3～0.5μmol/L引物，0.3～0.5mmol/L？dNTPs；所述引物为针对动物源性基因序列的通用引物SEQ？ID？NO：1和SEQ？ID？NO：2；(4)上样缓冲液所述上样缓冲液的组成为：2.0～3.0g/L溴酚蓝、350～450g/L蔗糖。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：罗海英，柯振华，吴玉銮，郭新东，刘春生，冼燕萍，陈筱婷，陈意光，罗东辉，吴文海，
申请(专利权)人：广州市质量监督检测研究院，
类型：发明
国别省市：
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