筛选细胞周期素依赖性激酶5抑制剂的方法，解决了现有筛选细胞周期素依赖性激酶5抑制剂技术中，荧光法易受干扰，放射法对人体有害、污染环境、成本高的的技术问题，本发明专利技术以十肽Pro-Lys-Thr?-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu为底物，细胞周期素依赖性激酶5在30-37℃催化底物生成产物磷酸化十肽Pro-Lys-Thr(磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu，用超高效液相色谱和质谱对产物定量，进一步计算出待测物的抑制率，本发明专利技术的方法准确、快速，可用于评价细胞周期素依赖性激酶5的催化活性及细胞周期素依赖性激酶5抑制剂的筛选。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分析化学领域，具体涉及一种筛选细胞周期素依赖性激酶5(cdk5/p25)抑制剂的方法。
技术介绍
阿尔兹海默病(alzheimer’ s disease, AD)是一种进行性神经系统退行性疾病，其主要病理改变为老年斑(senile plaque, SP)和神经元纤维缠结(neurofibrillarytangle, NFT)。后者为高度磷酸化的Tau蛋白聚集而成。细胞周期素依赖性激酶5 (Cyclin-dependent kinase 5, cdk5)与其调节蛋白p25结合后具有生物活性在神经系统中表达丰富，在AD病人Tau的过度磷酸化中发挥重要作用。所以筛选细胞周期素依赖性激酶5的抑制剂对开发新药有着非常重要的意义。 目前用于主要有化学萤光法(chemiluminescent assay)和放身寸法等(Lee V. ; Trojanowski J. Curr. Biol. 1992,2，653-656 ；Evans, D. B. ; Rank Κ. B. ; Sharma S. K. J. Biochem. Biophys. Methods2002，50，151-161 ;Bancher，C., Brunner, C. , Lassmannj H. , Budkaj H. , JellingerjK.，Wichej G.，Seitebergerj F.，Grundke-Iqbalj I.，Iqbal, K. and Wisniewski,H.M. Brain Res. 1989,477, 90-99)。化学萤光法易受到背景干扰，容易得到假阳性或假阴性结果；放射法因为使用到放射性元素，对环境和人体有害，需要专门的实验室及专业的操作人员，放射性废弃物处理需要专门的处理。且以上两种方法均需标记物，极大地增加了筛选成本(Kosik S. K. Alzheimer’s plaques and tangles: advances on both fronts.Trends Neurosci. 1991, 14, 218-219)。现代质谱仪的高精确度和灵敏度为我们提供了不受干扰的分子指纹图谱，串联质谱高度特异性和精确性揭示待分析化合物的结构信息，且质谱方法可以同时检测和定量多种组分，近年来在药物筛选中得到了广泛的应用(Lee，V. Μ.-Y.，Balin, B. J., Otvos, L.and Trojanowski, J. Q. Science，1991，251，675-678)。但现有技术中还未有用质谱检测方法。酶促反应缓冲液中往往含有不挥发的盐和为保持酶活性稳定的添加物，盐和添加物可能会污染质谱仪的离子源并导致离子化抑制，样品进入质谱前使用高效液相进行分离可以避免反应体系中的盐和添加物对检测的影响(Arjen R. de Boer, Thomas Letzel,Danny A. van Elswijk, Henk Lingeman, Wilfried M. A. Niessen, and Hubertus Irth.Anal. Chem. 2004，76，3155—3161)。
技术实现思路
为解决现有的筛选细胞周期素依赖性激酶5的技术中，荧光法易受干扰，放射法对人体有害、污染环境、成本高的的技术问题，本专利技术提供一种。本专利技术提供一种，其包括以下步骤(I)酶促反应缓冲液的配制缓冲液由三氢甲基氨基甲烷盐酸、二硫苏糖醇和氯化镁制成，或由醋酸铵、二硫苏糖醇和氯化镁制成，PH值为6-8 ；(2)标准品的配制将憐酸化十妝Pro-Lys-Thr (憐酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu 分别配成浓度为156纳摩尔/升、312纳摩尔/升、625纳摩尔/升、I. 25微摩尔/升、2. 5微摩尔/升、5微摩尔/升、10微摩尔/升、20微摩尔/升的标准品溶液，且每个浓度的标准品溶液均含I微摩尔/升的磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Val作为内标； (3)对照品和样品的酶促反应对照品反应总体积50微升，终浓度为20纳摩尔/升的细胞周期素依赖性激酶5，终浓度为50微摩尔/升的底物十肽Pro-Lys-Thr-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu,终浓度为50微摩尔/升的三磷酸腺苷，其余以缓冲液补足；样品反应总体积50微升，终浓度为20纳摩尔/升的细胞周期素依赖性激酶5，终浓度为O. 25-10微摩尔/升的待测物，终浓度为50微摩尔/升的底物十肽Pro-Lys-Thr-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu,终浓度为50微摩尔/升的三磷酸腺苷，其余以缓冲液补足；对照品和样品在30-37 °C反应30-60分钟后，分别加入有机溶剂终止反应，然后分别加入终浓度为I微摩尔/升的内标磷酸化十肽Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Ala-Lys-Lys-Val ；(4)标准品、对照品和样品的检测对标准品进行超高效液相色谱和质谱检测，从总离子流图中分别提取Pro-Lys-Thr(憐酸化)-Pro-Lys-Ala-Lys-Lys-Val 的2+和3+的色谱图，从总离子流图中分别提取 Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu 的2+和3+的色谱图，分别积分求峰面积，以标准品浓度为横坐标，以Pro-Lys-Thr(磷酸化)-Pro-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu 的2+ 和3+ 的峰面积之和与 Pro-Lys-Thr (憐酸化)-Pro-Lys-Ala-Lys-Lys-Val的2+和3+的峰面积之和的比值为纵坐标，得到 Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu 浓度的线性方程；对对照品和样品溶液进行超高效液相色谱和质谱检测；所述的超高效液相色谱的检测条件色谱柱安捷伦SB-C18 3. 0*100毫米，I. 8微米；流动相水和乙腈；梯度洗脱程序0-1分钟,4%乙腈；1-5分钟，4%_8%乙腈；5-10分钟，8%-10%乙腈；10-20分钟，10%-60%乙腈；流速0· 2毫升/分钟；进样量5微升；所述的质谱检测条件毛细管电压3500伏特；气体温度350摄氏度；雾化器温度350摄氏度；干燥气流速9升/分钟；雾化气气压275. 8千帕；锥孔电压65伏特；(5)待测物对细胞周期素依赖性激酶5的抑制率分别计算对照品、样品中产物Pro-Lys-Thr (磷酸化)-Pro-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu的2+和3+的峰面积之和与内标Pro-Lys-ThH磷酸化)-Pro-Lys-Ala-Lys-Lys-Val 的2+ 和3+ 的峰面积之和的比值，根 据⑷得到的线性方程中，求得对照品和样品中产物磷酸化十肽Pro-Lys-Thr(磷酸化)-Ρ -Lys-Ala-Lys-Lys-Leu的浓度，计算出待测物对细胞周期素依赖性激酶5的抑制率。优选的是，所述的缓冲液的pH为7. 4。优选的是，所述的pH值为6-8的缓冲液是由50毫摩尔/升三氢甲基氨基甲烷盐酸，O. 5毫摩尔/升二硫苏糖醇，5毫摩尔/升氯化镁和盐酸配制而本文档来自技高网...
【技术保护点】
筛选细胞周期素依赖性激酶5抑制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)酶促反应缓冲液的配制缓冲液由三氢甲基氨基甲烷盐酸、二硫苏糖醇和氯化镁制成，或由醋酸铵、二硫苏糖醇和氯化镁制成，pH值为6？8；(2)标准品的配制将磷酸化十肽Pro？Lys？Thr(磷酸化)？Pro？Lys？Ala？Lys？Lys？Leu分别配成浓度为156纳摩尔/升、312纳摩尔/升、625纳摩尔/升、1.25微摩尔/升、2.5微摩尔/升、5微摩尔/升、10微摩尔/升、20微摩尔/升的标准品溶液，且每个浓度的标准品溶液均含1微摩尔/升的磷酸化十肽Pro？Lys？Thr(磷酸化)？Pro？Lys？Ala？Lys？Lys？Val作为内标；(3)对照品和样品的酶促反应对照品：反应总体积50微升，终浓度为20纳摩尔/升的细胞周期素依赖性激酶5，终浓度为50微摩尔/升的底物十肽Pro？Lys？Thr？Pro？Lys？Lys？Ala？Lys？Lys？Leu，终浓度为50微摩尔/升的三磷酸腺苷，其余以缓冲液补足；样品：反应总体积50微升，终浓度为20纳摩尔/升的细胞周期素依赖性激酶5，终浓度为0.25？10微摩尔/升的待测物，终浓度为50微摩尔/升的底物十肽Pro？Lys？Thr？Pro？Lys？Lys？Ala？Lys？Lys？Leu，终浓度为50微摩尔/升的三磷酸腺苷，其余以缓冲液补足；对照品和样品在30？37℃反应30？60分钟后，分别加入有机溶剂终止反应，然后分别加入终浓度为1微摩尔/升的内标磷酸化十肽Pro？Lys？Thr(磷酸化)？Pro？Lys？Ala？Lys？Lys？Val；(4)标准品、对照品和样品的检测对标准品进行超高效液相色谱和质谱检测，从总离子流图中分别提取Pro？Lys？Thr(磷酸化)？Pro？Lys？Ala？Lys？Lys？Val的[M+2H]2+和[M+3H]3+的色谱图，从总离子流图中分别提取Pro？Lys？Thr(磷酸化)？Pro？Lys？Ala？Lys？Lys？Leu的[M+2H]2+和[M+3H]3+的色谱图，分别积分求峰面积，以标准品浓度为横坐标，以Pro？Lys？Thr(磷酸化)？Pro？Lys？Ala？Lys？Lys？Leu的[M+2H]2+和[M+3H]3+的峰面积之和与Pro？Lys？Thr(磷酸化)？Pro？Lys？Ala？Lys？Lys？Val的[M+2H]2+和[M+3H]3+的峰面积之和的比值为纵坐标，得到Pro？Lys？Thr(磷酸化)？Pro？Lys？Ala？Lys？Lys？Leu浓度的线性方程；对对照品和样品溶液进行超高效液相色谱和质谱检测；所述的超高效液相色谱的检测条件：色谱柱：安捷伦SB？C183.0*100毫米，1.8微米；流动相：水和乙腈；梯度洗脱程序：0？1分钟，4%乙腈；1？5分钟，4%？8%乙腈；5？10分钟，8%？10%乙腈；10？20分钟，10%？60%乙腈；流速：0.2毫升/分钟；进样量：5微升；所述的质谱检测条件：毛细管电压：3500伏特；气体温度：350摄氏度；雾化器温度：350摄氏度；干燥气流速：9升/分钟；雾化气气压：275.8千帕；锥孔电压：65伏特；(5)待测物对细胞周期素依赖性激酶5的抑制率分别计算对照品、样品中产物Pro？Lys？Thr(磷酸化)？Pro？Lys？Ala？Lys？Lys？Leu的[M+2H]2+和[M+3H]3+的峰面积之和与内标Pro？Lys？Thr(磷酸化)？Pro？Lys？Ala？Lys？Lys？Val的[M+2H]2+和[M+3H]3+的峰面积之和的比值，根据(4)得到的线性方程中，求得对照品和样品中产物磷酸化十肽Pro？Lys？Thr(磷酸化)？Pro？Lys？Ala？Lys？Lys？Leu的浓度，计算出待测物对细胞周期素依赖性激酶5的抑制率。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘淑莹，陈宁，牛俊，杨洪梅，宋凤瑞，刘志强，
申请(专利权)人：中国科学院长春应用化学研究所，
类型：发明
国别省市：
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