本发明专利技术公开了一种克隆猪OPN4基因编码区全序列的方法，包括以下步骤：A1、提取猪视网膜组织中的总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA；A2、引物的设计及PCR反应：以哺乳动物该基因的保守区作为模板在起始密码子上游和终止密码子的下游设计保守引物：上游引物P1：5′-atgaaccctccttcacggcc-3′下游引物P2：5′-ctacatcctggggtccaggctg-3′；A3、PCR产物的回收和纯化；A4、克隆。该技术相比较分段克隆和RACE技术而言，目的PCR片段的长短大致明确，工作量小，只需克隆一次，具有成本低，效率高的优势。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术，尤其涉及的是一种一步法获取猪0PN4基因的完整⑶S区序列的方法。
技术介绍
0PN4(黑素视蛋白，Melanopsin),近年发现的一种视网膜神经节细胞表达的感光视蛋白。是一个慢反应的综合性的光色素，并充当昼夜变化的传导分子。现已证实Melanopsin阳性的神经节细胞是哺乳动物中继视锥、视杆细胞之外的第三种感光细胞，它可能与非脊椎动物体内的弹状细胞源于一种共同的感光细胞，而Melanopsin的功能则是参与瞳孔对光反射、生物昼夜节律调节等非视觉成像系统，研究该基因的作用和功能将对动物感光机制以及生物节律的调控机制的进一步研究奠定基础。RT-PCR克隆是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)以及分子克隆相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的基因片段，将合成的目的基因片段克隆到载体细胞基因中，然后用质粒PCR产物测序。此技术利用PCR技术能在体外进行有效的基因扩增，而不需要内切酶消化和连接酶处理，可利用这一技术很快获得其他依靠限制性内切酶消化的方法难于得到的PCR产物；克隆载体PCR测序能克服PCR产物测序引物近端的十几个碱基无法测序获得的缺点。与RACE (cNDA末端快速扩增)技术相比较而言，目的基因片段的长度明确，成本低，工作量小。该技术成功的关键是PCR引物的设计，在起始密码子的上游设计上游引物，在终止密码子的下游设计下游引物，使得PCR产物包含完整的基因编码区全序列。分段PCR克隆法将目的基因分成几段来分别克隆，然后做亚克隆测序拼接。成本高，工作量大耗时，一个基因分成几段就需要做几次克隆，然后再做序列接拼。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种一步法获取猪0PN4基因的完整⑶S区序列的方法。本专利技术的技术方案如下一种克隆猪0PN4基因编码区全序列的方法，包括以下步骤Al、提取猪视网膜组织中的总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA ；A2、引物的设计及PCR反应以哺乳动物该基因的保守区作为模板在起始密码子上游和终止密码子的下游设计保守引物；设计的引物为上游引物Pl :5' -atgaaccctccttcacggcc-3!下游引物P2 :5' -ctacatcctggggtccaggctg-3!用cDNA为模板进行梯度PCR操作确定普通PCR的扩增条件，温度为范围在50°C到65°C之间的8个温度点 PCR反应体系为IOul体系(5 ii L的2 XMaster Mix Tap,上下游引物各0. 5 ii L，2 ii L的cDNA，2 y L的ddH20.)，反应条件为95°C预变性5min，38个循环(94°C，30s ；50°C, 30s ；72°C，60s)，最后 72°C IOmin ；A3、PCR产物的回收和纯化；A4、克隆。所述步骤Al包括以下步骤用液氮将视网膜磨成粉末装入I. 5mE管，放入-80°C的超低温冰箱中备用；取新的I. 5ml的EP管,加入Iml的Trizol液,然后加入约80mg的视网膜组织粉末，用手摇晃混匀后，用震荡仪震荡约30秒后室温放置5分钟；加入0. 2ml的氯仿，盖紧离心管，4°C下13000rpm离心8分钟，取上层水相于一新的离心管，加入等体积的异丙醇，室温放置5分钟，4°C下12000rpm离心10分钟；弃去上清液，加入Iml的75%乙醇混匀，4°C下7500g离心5分钟；小心弃去上清液，然后用移液枪吸干管壁上多余的乙醇，加入30ul到IOOul的DEPC水；琼脂糖凝胶检测RNA的质量，将效果好的RNA立即反转录成cDNA。所述的方法，所述步骤A3包括以下步骤 a.将60iU PCR产物于I %的琼脂糖凝胶中电泳。用干净的手术刀割下所要回收的DNA的琼脂块，放入I. 5ml离心管称取重量。b.按每0. I克胶块加入300 U I溶胶液；于50°C水浴放置10分钟，其间不断温和地上下翻转EP管，以确定胶块充分溶解；c.溶解后的凝胶溶液加入吸附柱中，吸附柱放入收集管中，12000r/min离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中；d.向吸附柱加入700 ill漂洗液PW，12000r/min离心30sec，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中；e.向吸附柱加入500 ill漂洗液PW，12000r/min离心30sec，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中；12000r/min离心2min，尽量除去漂洗液；将吸附柱彻底晾干，以防止残留漂洗液影响下一步的试验；f.将吸附柱置于另一个干净的EP管中，向吸附膜中间位置悬空加入30uL洗脱液，室温放置2min, 12000r/min离心Imin收集DNA溶液；g.取2uL回收产物于1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，检测回收效率和纯度；所述的方法，所述步骤A4包括以下步骤(I)目的片段与载体连接将回收、检测后的目的片段与PMD-18T载体连接，根据TaKaRa的pMD_18T载体试剂盒使用说明书，操作连接体系为PMD-18T Vector0.5 U L纯化回后的PCR片段5uLSolution I4.5 P LTotal10.0 u L以上操作在冰上进行，稍离心混匀，16°C在PCR仪中连接12h，_20°C保存备用；(2)大肠杆菌感受态细胞的制备a.从无抗生素平板上挑取新鲜的E. coli JM109单菌落结种于10ml LB液体培养基中，37°C，250r/min摇菌培养过夜；b.取2ml活化过夜的菌液接种于含50ml LB液体培养基的锥形瓶中，37°C，250r/min摇菌培养至0D_ = 0. 3 ；c.将细菌培养物无菌操作下转移至50ml EP管中，冰浴lOmin，然后4°C 4000r/min离心IOmin,弃上清,收集菌体沉淀；d.加入20ml冰预冷的0. lmol/L CaCl2溶液重悬细胞，用吸管吹散，冰浴30min。再次4°C 4000r/min离心lOmin，弃上清，收集菌体沉淀；e.加入2ml冰预冷的0. lmol/L CaCl2溶液重悬细胞，用吸管吹散，4°C冰箱中放置过夜；f.按200ul/份加入15%冰预冷甘油，混匀分装，_70°C冻存备用；(3)连接产物的转化 a.吸取IOul连接物介入冰预冷的I. 5mlEP管中，再取出_70°C冻存的E. coli感受态细胞置于冰上融化，轻弹管壁使细胞混匀；b.小心吸取IOOiU细胞悬液加入到含有连接产物的EP管中，轻弹管壁，混匀后冰浴 30min ；c. 42°C水浴热激90sec,立即冰浴3min ；d.加入500 u I预热至37°C的LB液体培养基，37°C，250r/min摇菌培养45min ；e.吸取200 ii I菌液,用灭菌涂布器均勻布于加有Amp的LB固体培养基平板上,室温温浴至完全吸收，37°C培养箱中倒置过夜培养；(4)阳性菌落的筛选随机挑选菌落接种于LB氨节培养液中，培养至中等浓度后以菌液为模板，用于相应基因PCR扩增相同的引物及反应条件进行扩增。扩增产物用I. 0%琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定为所克隆基因后，取20 Ul交送北京六合华大生物工程技术有限公司完成测序。该技术相比较分段克隆和RACE技术本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种克隆猪OPN4基因编码区全序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：A1、提取猪视网膜组织中的总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA；A2、引物的设计及PCR反应：以哺乳动物该基因的保守区作为模板在起始密码子上游和终止密码子的下游设计保守引物：上游引物P1：5′？atgaaccctccttcacggcc？3′下游引物P2：5′？ctacatcctggggtccaggctg？3′；A3、PCR产物的回收和纯化；A4、克隆。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邹明峰，白林，康波，李学伟，帅素容，姜冬梅，朱砺，刘益平，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：
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