柔嫩艾美耳球虫裂殖子提取纯化的方法技术

本发明专利技术公开了一种柔嫩艾美耳球虫裂殖子提取纯化的方法，其步骤包括裂殖子释出和裂殖子纯化；所述裂殖子释出由机械法研磨释出和酶消化释出组成；酶消化释出过程中采用0.625‰胰酶和1.75‰牛磺脱氧胆酸钠为消化液，消化比较温和，有利于裂殖子健活，又能消除红细胞，获得纯净的裂殖子。本发明专利技术操作简便，成本低廉，分离纯化的效果理想，其分离的裂殖子不仅数量多、纯净、杂质少，且保持了其旺盛的活力，其适用于进行药物敏感性测定、疫苗研究和其他生物学等方面的研究。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物提取纯化技术，具体涉及。
技术介绍
鸡球虫病主要是由艾美耳属的多种球虫引起的一种土源性肠道寄生性原虫病。此病是通过球虫卵囊传播，因鸡吞食大量孢子化卵囊而感染，该病分布广，发生普遍，在鸡的各种禽病中球虫病的发生率最高，占1/6 1/5，常呈暴发性流行，15 50日龄的雏鸡发病率最高，死亡率可高达80%。由于鸡球虫病分布广，危害大，严重威胁着养鸡业的发展，因此许多专家学者从事球虫的分子生物学、免疫学(疫苗)、组织培养和抗药性等方面的研究，要进行这些研究，首先就必须纯化出大量的虫体(裂殖子)。目前裂殖子纯化选择的方法大致有3种第一种是利用比重差异进行纯化，如不连续梯度离心法、离心淘洗法；第二种是 酶消化法，即用酶消化肠内容物，再简单地过滤和离心来去除杂质；第三种方法是层析法，如用玻璃珠、合成纤维作层析剂来纯化。这些方法存在无法除去红细胞等杂质、回收率低、酶消化时间难于控制或操作复杂、纯化效果不佳或仪器试剂昂贵等缺点。目前，有研究者对层析法进行了改进，如安健在《柔嫩艾美耳球虫裂殖子的分离纯化》的文献中对DEAE-纤维素52层析柱法进行了改进，以改进的洗脱剂进行纯化得到较高纯度的第二代裂殖子，但其对洗脱液的条件要求较高，如洗脱液的PH值、离子浓度，而且还受外界条件如洗脱时的静水压、温度、层析柱松紧的影响，同时试验步骤繁多。试验中平均每只鸡获得裂殖子为6. 17 X IO5个，不能满足药物敏感性测定试验要求，而且DEAE-纤维素52层析柱价格较昂贵，成本较高。刘立恒等人在《柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子的分离纯化》的文献中将酶消化、离心洗涤、红细胞裂解和Percoll密度梯度离心等方法结合，获得了较高纯度和回收量的裂殖子(7. 25X IO6个/只)，其数量仍不够进行药物敏感性测定试验。因此探索一种更为有效的柔嫩艾美耳球虫的裂殖子分离纯化方法是非常有必要的，本专利技术综合了多种方法的优点，摸索出一种操作简单、方便、能获得大量高纯度裂殖子的提取方法，通过机械研磨、酶消化和裂解红细胞、离心洗涤、抽滤、离心浓缩等方法结合，成功对柔嫩艾美耳球虫的裂殖子进行了分离纯化，此方法操作简便，成本低廉，分离纯化的效果理想，其分离的裂殖子不仅数量多、纯净，杂质少，且保持了其旺盛的活力，可适用于进行药物敏感性测定、疫苗研究和其他生物学等方面的研究。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术中存在的不足，而提供一种，其操作简单，分离纯化效果良好，杂质少。本专利技术采用低浓度胰酶和牛磺脱氧胆酸钠为消化液，有利于确保裂殖子的存活率。本专利技术的技术方案，其步骤包括裂殖子释出和裂殖子纯化。所述裂殖子释出由机械法研磨释出和酶消化释出组成；所述机械法研磨释出是将感染了孢子化卵囊后发育至裂殖子阶段的离体的鸡盲肠黏膜机械刮下，然后将黏膜组织充分研磨，使裂殖子游离出来。所述的离体的鸡盲肠黏膜是从已经感染柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊并已经死亡的鸡体内获取的盲肠黏膜。所述酶消化释出是将经过机械法研磨释出的黏膜膜组织按体积比1:广I. 5的量加入PH值为7. 2 7. 4的PBS溶液(磷酸盐缓冲溶液)研磨混匀，再用8(T100目筛粗过滤后，向滤液中按体积比I:广I. 5的量加入0. 625%。胰酶和I. 75%。牛磺脱氧胆酸钠混合液，充分摇匀，置37 38°C摇床消化，每隔l(Tl5min镜检一次，当观察到大多数裂殖体破裂，释出裂殖子，无红细胞时，按2. 5%加入小牛血清(100毫升组织滤液加入2. 5毫升小牛血清)终止消化反应，得到消化好的黏膜组织液。所述裂殖子纯化是指将裂殖子释出的黏膜组织液用8(T100目筛粗过滤，滤液经250(T3000r/min离心l(Tl5min，将沉淀用pH值为7. 2 7. 4的PBS溶液重悬 ，然后再用100^800目筛抽滤，滤液再经80(T1000目筛抽滤一次，即可获得纯化的裂殖子。将滤液离心浓缩至需要浓度，用血细胞计数板计算收获的裂殖子数量。本专利技术中的牛磺脱氧胆酸钠用于去除红细胞。裂殖子活率检测裂殖子活率检查采用活细胞拒抗伊红Y染色法检测(伊红染色液0. Ig伊红Y;0. 425g Nacl ;用去离子水定容至50mL)。纯化后的一份裂殖子悬液加一份伊红染色液，在显微镜下检查虫体活力，活虫体拒抗伊红染色，不着色，且活动力好；死虫体被染成红色，虫体展直不动，虫体无活动力。用计数器数200个裂殖子，裂殖子活率=未染色的裂殖子数/总裂殖子数X 100%。本专利技术的优点I、本专利技术的操作简单，成本低廉，纯化效果良好，回收率高，成活率高，可达到97%。2、本专利技术采用0. 625%。胰酶和I. 75%。牛磺脱氧胆酸钠参与消化反应，消化比较温和，有利于裂殖子健活，又能消除红细胞，获得纯净的裂殖子。比其他只采用消化酶或是采用胰酶和胆盐其他配比的消化酶和去红细胞液参与消化的效果好，不会出现裂殖子破裂或存在红细胞的现象。3、本专利技术纯化得到的裂殖子适用于进行药物敏感性测定、疫苗研究和其他生物学等方面的研究。附图说明图I为100倍放大下的机械法研磨释出后的裂殖子显微镜观察图，图中箭头所指为裂殖体，可以观察到有大量裂殖体和组织细胞；图2为400倍放大下的机械法研磨释出后的裂殖子显微镜观察图，图中箭头所指为红细胞和杂质，可以观察到混杂有大量组织细胞和红细胞；图3为400倍放大下的酶消化并纯化后的裂殖子显微镜观察图，图中箭头所指为裂殖子，可以观察到酶消化并纯化后为纯裂殖子，无混杂有组织细胞和红细胞等杂质；图4为400倍放大下的裂殖子纯化的伊红染色图(I)，图中箭头所指为活裂殖子，不被染色的，因为活虫体不着色；死虫体被染成红色；图5为400倍放大下的裂殖子纯化的伊红染色图(2)，图中箭头所指为死亡裂殖子，被染成红色，因为活虫体不着色；死虫体被染成红色。具体实施例本专利技术用下列实施例进行说明，但不限制本专利技术的范围。实施例I，步骤如下(I)裂殖子释出a)机械法研磨释出将感染了孢子化卵囊后发育至裂殖子阶段的离体的鸡盲肠黏膜机械刮下，再将黏膜组织充分研磨，使裂殖子游离出来；取些许组织液进行显微镜镜检如图I和图2所示，(图I和图2均是将组织液滴在玻片上进行显微镜观察拍照)，从图中可 以观察到裂殖子中混有大量的肠上皮细胞、粪便残渣和红细胞等杂质。b)酶消化释出将步骤a)机械法研磨释出的黏膜组织按体积比1:1的量加入pH值为7. 2的PBS溶液研磨混匀，再用8(Tl00目筛粗过滤后，取出IOml滤液再加入IOml的0. 625%。胰酶和I. 75%。牛磺脱氧胆酸钠混合液，充分摇匀，置37°C摇床消化，每隔IOmin镜检一次，当观察到大多数裂殖体破裂，释出裂殖子，无红细胞时，按体积比加入2. 5%小牛血清终止消化反应，得到黏膜组织液。(2)裂殖子纯化将步骤(I)裂殖子释出的黏膜组织液用8(T100目筛粗过滤，滤液经3000r/min，离心lOmin，将沉淀用pH值为7. 2的PBS溶液重悬，然后再用100 800目铜筛抽滤，滤液再经800目铜筛抽滤一次，即可获得纯化的裂殖子。将滤液离心浓缩至需要浓度，用血细胞计数板计算收获的裂殖子数量，从一只离体鸡盲肠上获得裂殖子5. 14X108个。取些许组织液进行显微镜镜检如图3所示(图3是将纯化后液体滴在计数板上进行显微镜观本文档来自技高网...

【技术保护点】
柔嫩艾美耳球虫裂殖子提取纯化的方法，其步骤包括裂殖子释出和裂殖子纯化；其特征在于：所述裂殖子释出由机械法研磨释出和酶消化释出组成；所述机械法研磨释出是将感染了孢子化卵囊后发育至裂殖子阶段的离体的鸡盲肠黏膜机械刮下，然后将黏膜组织充分研磨，使裂殖体游离出来；所述酶消化释出是将经过机械法研磨释出的黏膜膜组织按体积比1？:？1~1.5的量加入pH值为7.2~7.4的PBS溶液研磨混匀，再用80~100目筛粗过滤后，向滤液中按体积比1？:？1~1.5的量加入0.625‰胰酶和1.75‰牛磺脱氧胆酸钠混合液，充分摇匀，置37~38℃摇床消化，每隔10~15min镜检一次，当观察到大多数裂殖体破裂，释出裂殖子，无红细胞时，按2.5%加入小牛血清终止消化反应，得到黏膜组织液。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：谢永平，彭昊，马春霞，李军，杨威，陈泽祥，潘艳，许力干，禤雄标，胡帅，谢宇舟，
申请(专利权)人：广西壮族自治区兽医研究所，
类型：发明
国别省市：