本发明专利技术涉及一种毒素的检测方法，特别涉及一种水产品中雪卡毒素的检测方法。本发明专利技术采用快速溶剂萃取-固相萃取-液相色谱-串联质谱法（ASE-SPE-HPLC/MS/MS）检测水产品中的雪卡毒素，通过快速溶剂萃取，大大提高了雪卡毒素的回收率，并结合C18柱和硅胶柱两种SPE小柱，有效去除了其他物质的干扰，提高了实际检测的灵敏度，且HPLC/MS/MS具有较强的分离能力、定性分析结果可靠、检测限低等优点，本发明专利技术适合水产品中雪卡毒素的定性定量检测及食品安全监测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及ー种毒素的检测方法，特别涉及。
技术介绍
雪卡毒素中毒是ー种全球爆发的海洋食源性疾病，其中太平洋属雪卡毒素是最毒的雪卡毒素，食用含有0. lPg/kg的珊瑚鱼即可引起中毒。雪卡毒素(P-CTXl)是ー类脂溶性聚醚化合物，由13个连续连接成阶梯状的醚环组成，包括5，6，7，8，9元醚环，整个骨架具有反式或顺式的立体化学特征。性质为耐热、易被氧化、不溶于水、可溶于极性有机溶剤。其来源于ー种腰鞭毛藻-冈比尔盘藻(Gambierdiscus toxicus),并能通过食物链的传递而影响到人类的生命健康，毎年都有西加毒素中毒的相关报道。目前国内外已有多种检测方法，但是每种方法都有其优缺点，主要的方法有小鼠生物法、细胞毒性试验、高效液相色谱-质谱分析、免疫測定法等。小鼠生物法的缺点是特异性差、灵敏度低、准确性和重现性·差、不能断定个体毒素成分、操作要求较高技巧、对试验动物的种系及体重要求苛刻；细胞毒性试验的缺点是该技术特异性差，不能确定毒素的准确成分，实验配置及操作人员的技术要求高；免疫測定法的缺点是可能非特异性的检测出其它的聚醚类海洋毒素，引起假阳性的产生；高效液相色谱/质谱分析(HPLC/MS)这种方法具有灵敏度高，可比性和重复性好，可检测样品中各种毒素成分的实际含量水平等特点，一般将HPLC/MS作为其它检测的方法的重要辅助方案，提供准确的參考标准，但是该方法基质效应干扰较大，回收率普遍不高，波动在27%-75%之间。Dechraoui等采用样品均质后超声提取鱼体内的雪卡毒素，优化了样品前处理步骤，但是回收率仍然不稳定。刘红河等将鱼类样品经丙酮提取后，用冷冻脱月旨，经PSA固相萃取柱浄化后，C18色谱柱分离，采用电喷雾串联四极杆质谱进行检测，方法的定量检出限为0. lg/L，平均回收率为82. 3^-87.2 ^因此HPLC/MS是目前研究热点，但至今尚未建立ー种快速溶剂萃取-固相萃取-液相色谱-串联质谱法(ASE-SPE-HPLC/MS/MS)检测水产品中雪卡毒素的检测方法。国内已经在申报的检测雪卡毒素的专利技术专利有申请号为CN201110149270. 5公开的一种雪卡毒素钠离子荧光探针检测法和申请号为CN201010277323. 7提供的一种毛细管电泳电化学酶联免疫分析检测雪卡毒素，但是这些方法实际检测时灵敏度不高，对于水产品中雪卡毒素的快速检测应用难度较大。
技术实现思路
本专利技术提供ー种定性分析结果可靠、检测限低、适用于水产品中雪卡毒素的快速检测的检测方法。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是 ，该方法包括如下步骤 a、样品前处理将待测的鱼肉样品充分混匀并搅碎，装入容器内，密封、冷藏备用； b、快速溶剂萃取准确称取经前处理的鱼肉样品，放于瓷研钵中，与等重量的硅藻土混匀后转移至不锈钢萃取池中，萃取池两端用玻璃纤维滤膜密封，萃取池用甲醇快速溶剂萃取(ASE)，收集全部萃取溶剂，萃取液于负压状态旋转蒸发干燥处理后，用甲醇溶解，得到粗提液； C、固相萃取上述粗提液加入等量的去离子水，混匀后依次用SPE固相萃取C18柱浄化和SPE硅胶柱浄化，洗脱液氮气吹干，甲醇溶解后待测； d、液相色谱-串联质谱分析ESI+模式，选择离子化后的CTX的分子离子[M+NHJ+作为母离子，其 m/z 为 1128. 7，子离子 m/z 为 1093. 7、1075. 7,1057. 7、1039. 7，MRM 监测。e、雪卡毒素标准曲线的制备，取无毒石斑鱼肌肉样品的基质加标配制成系列浓度，求出回归方程与相关系数，根据标准曲线以确定被检测样品中雪卡毒素的含量。本专利技术通过快速溶剂萃取，大大提高了雪卡毒素的回收率，并结合C18柱和硅胶柱两种SPE小柱，有效去除了其他物质的干扰，提高了实际检测的灵敏度，且HPLC/MS/MS具有·较强的分离能力、定性分析结果可靠、检测限低等优点，本专利技术适合水产品中雪卡毒素的定性定量检测及食品安全监测。作为优选，快速溶剂萃取的条件为压カ为1500 psi，温度设定在75_85°C，升温和静止时间均为5-8min，吹扫时间为60_80s，循环2_3次，收集全部萃取溶剤。作为优选，SPE固相萃取C18柱上样后，分别用甲醇水溶液清洗和洗脱，得到洗脱液；在洗脱液中加入三氯甲烷和IM NaCl溶液，其中，洗脱液、三氯甲烷和NaCl溶液的体积比为12 10 :6. 3-10，漩涡混匀，4000-8000rpm离心，弃去上层液体，N2吹干，得到的残渣用三氯甲烷溶解，上样到预先用三氯甲烷平衡好的SPE硅胶柱中，上样后，用三氯甲烷清洗，三氯甲烷和甲醇的混合液洗脱，洗脱液N2吹干，用甲醇溶解，得到P-CTXl甲醇溶液。洗脱液中加入IM NaCl溶液，可以有效防止溶液的乳化作用，提高回收率。清洗液三氯甲烷的体积可以根据实际情况选择，清洗液越多，清洗效果越好，但是耗费时间长。作为优选，固相萃取中，用于清洗的甲醇水溶液，甲醇和水的体积比为13:7 ;用于洗脱的甲醇水溶液，甲醇和水的体积比为4:1 ;所述三氯甲烷和甲醇的混合液中，三氯甲烷和甲醇的体积比为9: I。作为优选，固相萃取中涉及的洗脱过程洗脱速度均为3mL/min。作为优选,步骤d中色谱条件为色谱柱Luna C18 column (250X2. 0mm, 5 u m;Phenomenex, Manchester, UK)或相当者；柱温25. 0°C;进样量20. OML ;流动相A :5mM的甲酸铵+0. 1%的甲酸，B :こ腈。作为优选，所述的步骤还包括回收率实验。本专利技术具有以下优点 I、应用范围广。本专利技术可加强海洋生物的雪卡毒素的监控，有利于改善海洋环境，从源头上控制雪卡毒素的产生。有利于水产品流通环节中的监控减少食品中雪卡毒素中毒事件，保障食品安全。2、本专利技术采用了快速溶剂萃取(ASE)进行加温、加压萃取，与传统提取方法相比，提高了雪卡毒素的提取效率，并节约了提取溶剂(提取溶剂的体积为40mL，而传统方法的提取溶剂高达300mL)，減少了超声提取后后期带来的繁琐手工操作。3、本专利技术采用了快速溶剂萃取-固相萃取-液相色谱-串联质谱法(ASE-SPE-HPLC/MS/MS)检测水产品中的雪卡毒素，大大提高了雪卡毒素的回收率，并结合C18柱和硅胶柱两种SPE小柱，有效去除了其他物质的干扰，提高了实际检测的灵敏度，且HPLC/MS/MS具有较强的分离能力、定性分析结果可靠、检测限低等优点，与传统的检测方法相比，具有更好的利用价值。4、仪器自动进样，适合大批量生物样品的检测。附图说明图I为利用本专利技术涉及的雪卡毒素标准色谱 图2为利用本专利技术涉及的雪卡毒素标准质谱 图3为利用本专利技术涉及的样品中雪卡毒素色谱 图4为利用本专利技术涉及的样品中雪卡毒素质谱图；· 图5为利用本专利技术涉及的空白样品色谱图。具体实施例方式下面通过具体实施例，对本专利技术的技术方案作进ー步的具体说明。应当理解，本专利技术的实施并不局限于下面的实施例，对本专利技术所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本专利技术保护范围。在本专利技术中，若非特指，所有的份、百分比均为重量単位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。实施例I ASE-SPE-HPLC/MS/MS检测水产品中的雪卡毒素 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种水产品中雪卡毒素的检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤：a、样品前处理：将待测的鱼肉样品充分混匀并搅碎，装入容器内，密封、冷藏备用；b、快速溶剂萃取：准确称取经前处理的鱼肉样品，放于瓷研钵中，与等重量的硅藻土混匀后转移至不锈钢萃取池中，萃取池两端用玻璃纤维滤膜密封，萃取池用甲醇快速溶剂萃取(ASE)，收集全部萃取溶剂，萃取液于负压状态旋转蒸发干燥处理后，用甲醇溶解，得到粗提液；c、固相萃取：上述粗提液加入等量的去离子水，混匀后依次用SPE固相萃取C18柱净化和SPE硅胶柱净化，洗脱液氮气吹干，甲醇溶解后待测；d、液相色谱？串联质谱分析：ESI+模式，选择离子化后的CTX的分子离子[M+NH4]+？作为母离子，其m/z为1128.7，子离子m/z为1093.7、1075.7、1057.7、1039.7，MRM监测；e、雪卡毒素标准曲线的制备，取无毒石斑鱼肌肉样品的基质加标配制成系列浓度，求出回归方程与相关系数，根据标准曲线以确定被检测样品中雪卡毒素的含量。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周秀锦，周向阳，邵宏宏，万婧，颜建波，董莉莉，
申请(专利权)人：舟山出入境检验检疫局综合技术服务中心，周秀锦，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。