本发明专利技术涉及一种猪α干扰素成熟蛋白重组腺病毒及其构建方法与应用，它是将猪α干扰素表达基因插入到穿梭载体pShuttle-CMV中，制得pShuttle-CMV-mIFNα；然后将pShuttle-CMV-mIFNα与腺病毒骨架载体pAdEasy-1发生同源重组，获得重组腺病毒质粒pAd-mIFNα；再经脂质体转染细胞、包装，获得猪α干扰素成熟蛋白重组腺病毒rAd-mIFNα。本发明专利技术构建的猪α干扰素成熟蛋白重组腺病毒外源蛋白表达稳定，且滴度高而稳定，重组腺病毒的滴度稳定在108.67TCID50/mL，与现有干扰素相比，本发明专利技术构建的重组腺病毒滴度提高了10000倍。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种猪α干扰素成熟蛋白(mIFNa )重组腺病毒及其构建方法与应用，属于生物技术
技术介绍
猪α干扰素具有广谱、高效抗病毒、抗肿瘤的作用，其对免疫系统起关键的调节作用，猪α干扰素对入侵病毒的非特异性抑制功能，对许多重大传染病致病病毒具有有效地防御功能。基因工程制备的猪α干扰素与血源性干扰素相比，具有无污染、安全性高、纯度高、比活性高、成本低、疗效确切等优点。中国专利文献CN101845441A (申请号201010125057. 6)公开了一种复合猪α干扰素基因及其重组载体，属于基因工程生物制品
将新设计的复合猪α干扰素的·基因序列重组到PPICZ a -A载体，电转化入酵母菌感受态细胞，阳性鉴定、高拷贝酵母菌株的筛选、诱导表达。该系统表达的复合猪α干扰素效价较低，应用猪体后，降解较快，不利于临床应用。重组腺病毒rAdnIFN α在分类上属于腺病毒科(Adenoviridae),哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus),人腺病毒种(Human adenovirus),该重组腺病毒可以对目的蛋白进行有效地表达，用该重组腺病毒感染动物后不出现临床症状，因此可以用来表达抗原蛋白。重组腺病毒基因工程技术在人类的基因治疗方面已经取得了广泛地应用，很多应用于人类基因治疗的重组腺病毒已经进入临床三期阶段。因为重组腺病毒具有感染宿主范围广，能够感染分裂和不分裂的细胞；可以表达人源和非人源蛋白；而且不会整合到宿主基因组中，不会引起基因插入突变，可以复制得到高滴度等特点。中国专利文献CN1275084A (申请号98809116. X)公开了一种重组的猪腺病毒载体，包括稳定整合并能表达至少一种异源核苷酸序列的重组猪腺病毒的重组载体。核苷酸序列优选地是编码猪霍乱病毒或假狂犬病病毒的抗原决定簇的序列。该腺病毒载体无法满足猪α干扰素的表达要求。中国专利文献CN1970774 (申请号200610124194)公开了一种猪α干扰素重组腺病毒及其构建方法，其构建方法步骤如下猪α干扰素IFN-α基因的扩增、克隆；含有IFN-a基因的重组穿梭载体的构建；重组腺病毒质粒载体的构建；重组腺病毒的获得。还公开了猪a干扰素重组腺病毒在制备抗病毒疫苗中的应用。该方法获得的重组腺病毒滴度较低，而且带有GFP标签，不能应用于临床。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种猪α干扰素成熟蛋白(mIFNa )重组腺病毒及其构建方法与应用。本专利技术是通过以下技术方案实现的一种猪a干扰素成熟蛋白重组腺病毒，其特征在于，将猪a干扰素表达基因插入到穿梭载体 pShuttle-CMV 中，制得 pShuttle-CMV-mlFNα ;然后将 pShuttle-CMV-mlFNα与腺病毒骨架载体pAdEasy-Ι发生同源重组，获得重组腺病毒质粒pAchmIFN α ;再经脂质体转染细胞、包装，获得猪ct干扰素成熟蛋白重组腺病毒rAd-mlFNa。根据本专利技术优选的，所述的猪α干扰素表达基因序列如SEQ ID NO. I所示。根据本专利技术优选的，所述重组腺病毒质粒pAd-mlFNa的基因序列如SEQ ID NO. 4所示。根据本专利技术优选的,所述的脂质体为脂质体Lipofectamine2000或293Fectin。根据本专利技术优选的，所述的细胞为293细胞或AD293细胞。上述猪α干扰素成熟蛋白重组腺病毒的构建方法，包括如下步骤 (I)提取猪的外周血单核淋巴细胞的总RNA，然后利用RT-PCR扩增猪α干扰素成熟蛋白基因，制得核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示的基因片段；(2)将步骤(I)制得的基因片段插入穿梭载体pShuttle-CMV中，制得含有猪mIFNa的重组腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV-mlFN a ；(3)将腺病毒骨架载体pAdEasy-1转化至由BJ5183大肠杆菌制备的感受态细胞，制得含pAdEasy-Ι的BJ5183细胞，然后制备含pAdEasy-Ι的BJ5183感受态细胞；(4)将步骤(2)制得的重组腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV-mlFNa电转化至由步骤(3)制得的含pAdEasy-Ι的BJ5183感受态细胞，经同源重组后，获得重组腺病毒质粒pAd-mlFNα ；(5)将步骤(4)制得的重组腺病毒质粒pAd-mlFNa经脂质体转染细胞、包装，获得猪ct干扰素成熟蛋白重组腺病毒rAd-mlFNa。所述步骤(I)中，RT-PCR的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所/Jn ο上述猪a干扰素成熟蛋白重组腺病毒在制备猪抗病毒感染药物中的应用。上述操作如无特殊说明，均可采取本领域常规技术。有益效果I、本专利技术构建的猪a干扰素成熟蛋白重组腺病毒外源蛋白表达稳定，且滴度高而稳定，重组腺病毒的滴度(组织细胞半数感染量)稳定在108 67TCID5(l/mL，与现有干扰素相t匕，本专利技术构建的重组腺病毒滴度提高了 10000倍；2、本专利技术表达的是猪a干扰素成熟蛋白，成熟蛋白是真正发挥抗病毒作用的蛋白，不包含降低重组病毒滴度的疏水信号肽干扰蛋白的表达；3、本专利技术表达猪a干扰素成熟蛋白的腺病毒载体，由于该重组腺病毒采用人血清5型腺病毒，对人、猪等动物没有致病性，不表达GFP蛋白，生产上更安全；4、本专利技术利用腺病毒载体首次表达猪a干扰素成熟蛋白，该重组腺病毒突破了常规猪a干扰素的局限性，使猪a干扰素提前表达，使猪提前获得抵抗病毒感染的能力；5、本专利技术所述重组腺病毒能在体内进行有限增值并且不断表达mIFNa蛋白，表达的mIFNa具有广谱抗病毒作用，通过抑制病毒的吸附、脱壳盒早期病毒核酸转录、病毒蛋白合成以及成熟病毒的释放等病毒感染过程的各个环节，起到抑制病毒增殖的效果；6、本专利技术所述重组腺病毒可以有效预防和治疗由病毒引起的猪的多种传染病，针对猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病等疾病有显著疗效，提高公猪的精液质量，降低母猪的流产、死胎、木乃伊胎及产仔数少等情况，实验证明，对猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病治愈率高达80-95%。本产品对猪瘟、口蹄疫等也有显著地疗效，显著降低由此引发的经济损失，使猪的生产性能大大提高。附图说明图I是重组猪α干扰素成熟蛋白腺病毒的生产工艺流程图；图2是重组腺病毒质粒的Pac I酶切鉴定的电泳图；图3是RT-PCR鉴定猪mIFN α重组腺病毒表达的电泳图；图4是Western-blot鉴定mIFNa重组腺病毒表达的电泳图； 具体实施例方式下面通过实施对本专利技术的技术方案作进一步说明，但本专利技术的保护范围不限于此。实施例中所述的腺病毒穿梭载体pShut11e-CMV、腺病毒骨架载体pAdEasy-1、BJ5183大肠杆菌、293细胞、AD293细胞均购自QbioGene公司；脂质体Lipofectamine2000、293Fectin购自Invitrogen公司；EcoR I内切酶、Xho I内切酶、Pac I内切酶购自NEB公司。实施例I猪α干扰素成熟蛋白重组腺病毒的构建方法，包括如下步骤一、猪α干扰素成熟蛋白腺病毒质粒(pAd-mlFNa )的构建I、细胞总RNA提取用淋巴细胞分离液(购自上海生工公司)分离猪的外周血单核淋巴细胞，将细胞用RPMI-1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种猪α干扰素成熟蛋白重组腺病毒，其特征在于，将猪α干扰素表达基因插入到穿梭载体pShuttle？CMV中，制得pShuttle？CMV？mIFNα；然后将pShuttle？CMV？mIFNα与腺病毒骨架载体pAdEasy？1发生同源重组，获得重组腺病毒质粒pAd？mIFNα；再经脂质体转染细胞、包装，获得猪α干扰素成熟蛋白重组腺病毒rAd？mIFNα。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孙文博，王金宝，黄保华，吴家强，宋恩亮，杜以军，李俊，丛晓燕，时建立，任素芳，吕伟，郭立辉，
申请(专利权)人：山东省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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