提供一种光学分析技术，其能够对以低的浓度或数密度包含于样品溶液中的被观测粒子的状态或特性进行检测。本发明专利技术的光学分析技术使用诸如共聚焦显微镜的或多光子显微镜的光学系统等能够对来自溶液中的微小区域的光进行检测的光学系统，以在使微小区域的位置在样品溶液中移动的同时（在利用微小区域扫描样品溶液的内部的同时）对来自被观测发光粒子的光进行检测，由此对横穿微小区域的内部的发光粒子单个地进行检测，以使得能够对发光粒子计数或能够获取关于发光粒子的浓度或数密度的信息。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及对来自分散或溶解于溶液中的原子、分子或团聚体(在下文中，这些均称作“粒子”)的光进行检测以用于分析溶液中的粒子的状态的光学分析装置、光学分析方法和用于光学分析的计算机程序，更具体地，本专利技术涉及如下的光学分析装置、光学分析方法和用于光学分析的计算机程序其能够通过使用诸如共聚焦显微镜的或多光子显微镜的光学系统等能对来自溶液中的微小区域的光进行检测的光学系统来获取对分析例如蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或其团聚体等生物分子以及例如病毒、细胞或非生物粒子等粒状物等等各种粒子的状态(相互作用、结合或离解状态，等等)有用的信息。
技术介绍
根据近年来在光学测量技术上的发展，通过使用共聚焦显微镜的光学系统和能够对光子计数(单光子检测)的超高灵敏度光检测技术，使得单光子或单荧光分子水平的微弱光的检测和/或测量成为可能。因此，提出了借助于这种微弱光检测技术对生物分子等的分子间相互作用、结合或离解反应进行检测的各种装置或方法。例如，在荧光相关光谱分析(Fluorescence Correlation Spectroscopy :FCS,参见例如专利文献I和2以及非专利文献1-3)中，借助于激光共聚焦显微镜的光学系统和光子计数技术，对样品溶液中的微小区域(显微镜的激光会聚的聚焦区域，称作“共聚焦体积”)内进出的荧光分子或荧光标记分子(荧光分子等)的荧光强度进行测量，并且基于由测得的荧光强度的自相关函数值所确定的荧光分子等在微小区域中的平均驻留时间(平移扩散时间)和驻留分子数的平均值，实现了荧光分子等的诸如运动速度、尺寸或浓度等信息的获取和/或诸如分子的结构或大小的变化、分子的结合或离解反应或者分散和团聚等各种现象的检测。此外，在荧光强度分布分析(Fluorescence Intensity Distribution Analysis :FIDA,例如专利文献3)或者光子计数统计分析(Photon Counting Histogram :PCH,例如专利文献4)中，生成了通过与FCS类似的方式测得的进出共聚焦体积的荧光分子等的荧光强度的直方图，并且通过将统计模型公式与直方图的分布拟合来计算荧光分子等的特征亮度的平均值以及共聚焦体积内驻留的分子的平均数，从而，将基于这些信息估算分子的结构或尺寸变化、结合或离解状态或者分散和团聚状态。此外，在专利文献5和6中，提出了基于使用共聚焦显微镜的光学系统测得的样品溶液中荧光信号的时间演进来检测荧光物质的方法。专利文献7提出了一种信号计算处理技术，其利用光子计数技术测量来自流过流式细胞仪的荧光微粒或者来自固定在基板上的荧光微粒的微弱光，以检测荧光微粒是否存在于流体中或者基板上。特别地，根据诸如FCS和FIDA等采用了使用共聚焦显微镜的光学系统和光子计数技术来对微小区域进行荧光测量的技术的方法，与现有技术相比，测量所需的样品量可以极少(一次测量所使用的量最多几十μ L)且浓度极低，并且测量时间也大幅缩短(在一次测量中，反复进行若干次时间为秒量级的测量)。因此，特别是在对医学或生物学研究和开发领域中常用的稀有或昂贵的样品进行分析时，或者在诸如疾病临床诊断或生物活性物质的筛选等对大量的样本进行试验时，期望这些技术与传统的生化方法相比是使得能够以低成本和/或快速地进行实验或试验的强力的手段。现有技术文献专利文献专利文献I :日本特开2005-098876专利文献2 :日本特开2008-292371 专利文献3 日本特许第4023523号专利文献4 :国际公开2008-080417专利文献5 :日本特开2007-20565专利文献6 :日本特开2008-116440专利文献7 :日本特开平4-337446号公报非专利文献非专利文献I :金城政孝，“蛋白质，核酸,酵素”，Vol. 44，No. 9,1431 — 1438页，1999 年。非专利文献2 F. J.梅耶-阿姆兹(F. J. Meyer-Alms),荧光相关光谱学(Fluorescence Correlation Spectroscopy), R.里格尔(R.Rigler)编，施普林格(Springer)，柏林，2000 年,204 — 224 页。非专利文献3 :加藤则子外4名，遗传子医学，Vol. 6，No. 2，271 — 277页。
技术实现思路
需要解决的技术问题在诸如FCS、FIDA和PCH等上述光学分析技术中，简要地说，通过统计处理算出测得的荧光强度的时间波动的大小，然后基于波动的大小确定在样品溶液中的微小区域内进出的荧光分子等的各种特性。因此，为了在上述光学分析技术中获得显著的结果，优选的是，以如下方式准备被用作样品溶液中的观测对象的荧光分子等的浓度或数密度使得在平衡状态下，在秒量级长度的一次测量时间内，有使得统计处理能够进行的数量的荧光分子等将进出微小区域，优选地使得在微小区域中将总是存在大约一个荧光分子等(典型地，由于共聚焦体积的体积为大约lfL，所以优选的是荧光分子等的浓度为大约InM以上)。换言之，当样品溶液中被观测粒子的浓度或数密度远远低于使得统计处理能够进行的水平(例如，远远低于InM)时，会出现在测量时间内很少有被观测对象进入到微小区域内的状态，因此，荧光强度的测量结果会包括很长一段时间的在微小区域内完全不存在被观测对象的状态，并且显著的荧光强度的观测量也会减小，因此，不能够期望在如上所述基于荧光强度的统计波动的光学分析技术中有显著的或精确的分析结果。在专利文献5和6中描述的使用共聚焦显微镜的光学系统检测荧光物质的方法中，在未对荧光强度波动如上所述地进行统计处理的情况下，能够根据持续数秒的测量时间内是否产生具有显著强度的荧光信号来确定样品中是否存在被观测荧光分子等，并且公开了，已经获得样品中具有显著强度的荧光信号的频率与荧光分子等的数量之间的相关性。特别地，在专利文献6中启示，搅动样品溶液的内部的随机流动的发生改善检测敏感度。然而，即使在那些方法中，也仅仅检测到是否存在由于扩散或随机流动而随机地进出微小区域的荧光分子等，而不能掌握微小区域内的荧光分子等的粒子的行为，所以，例如没有实现粒子的计数或者粒子的浓度或数密度的定量计算。此外，专利文献7中描述的技术在于检测流式细胞仪中的流体内是否存在单个荧光微粒或者检测是否存在固定于基板上的单个荧光微粒，而不是用于对在样品溶液中在通常状态下被溶解或分散的诸如分子和胶体等粒子、即在样品溶液中随机移动的粒子进行检测的技术，因此，没有实现定量地算出样品溶液内溶解或分散的粒子的浓度或数密度。此外，由于专利文献7的技术包括诸如流式细胞仪中的测量或将荧光粒子固定于基板的处理等过程，所以与诸如FCS、FIDA和PCH等光学分析技术的情况相比，大大地增加了试验所需的样品量，并且对于进行试验的人员可能要求复杂且先进的操作技术。因此，本专利技术的一个目的在于提供一种新的光学分析技术，该技术不包括诸如FCS,FIDA和PCH等光学分析技术中进行的统计处理，使得能够在包含的被观测粒子的浓度或数密度比诸如FCS、FIDA和PCH等光学分析技术所能够处理的水平低的样品溶液中检测被观测粒子的状态或特性。另外，本专利技术的另一目的在于提供一种实现上述新的光学分析技术的光学分析装 置、本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：山口光城，近藤圣二，田边哲也，堀邦夫，
申请(专利权)人：奥林巴斯株式会社，
类型：发明
国别省市：
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