本发明专利技术公开了一种枳抗寒转录因子PtrICE1基因及其在植物抗寒改良中的应用，申请人利用植物基因克隆技术从枳中克隆得到一个新基因PtrICE1，其核苷酸序列为SEQ?ID?NO：1所示，其中161-1840bp处为该基因的编码区，包含1680bp的开放阅读框；编码559个氨基酸，其编码的氨基酸序列为序列表SEQ?ID?NO：2所示，等电点为5.27，分子量为61kD。利用农杆菌介导的遗传转化方法转化烟草和柠檬，获得的转基因植株，经生物学功能验证，表明本发明专利技术克隆的PtrICE1基因具有调控抗寒功能。PtrICE1基因的发现，为植物抗非生物逆境分子设计育种提供新的基因资源，为实施绿色农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业生产成本和实现环境友好。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物基因工程领域。具体涉及ー种从积(Poncirust rifoliata)中分离、克隆得到一个编码MYC类型的bHLH (basic helix-loop-helix,碱性螺旋-环-螺旋)家族转录因子的基因PtrlCEl，还涉及一种枳抗寒转录因子PtrICEl基因在植物抗寒改良中的应用，将该基因转化烟草和柠檬，获得的转基因植株抗寒能力明显提高。
技术介绍
自然界中，植物生长在ー个开放的环境中，经常会受到恶劣环境如寒冻、高温、干旱、水涝和高盐等逆境的胁迫。低温是植物区域性和季节性的主要生态限制因子，低温冷害是农业生产的ー种严重的自然灾害。因此，弄清植物寒冻损伤及其抗寒性机理具有非常重要的理论意义和实践价值。事实上，植物在漫长的演变过程中，已经建立了一套应答逆境胁迫的机制，涉及到植物对逆境信号的感受、逆境信号的传递，以及相应受体对逆境信号的识别与转导等三个阶段，此过程受ー个错综复杂的信号通路调控。近年来，国内外在植物抗冻方面开展了大量工作，研究结果表明冷诱导基因在植物抗低温和冷驯化过程中起着重要的作用(Th omashow，1999)。这些冷诱导基因编码的产物可以分为两类，一类是与植物抗寒性的提高直接相关的功能性蛋白，比如一些涉及脂类代谢、糖代谢以及抗氧化的酶，分子伴侶，抗冻蛋白，其它起渗透调节作用的物质；另一类是调控性蛋白，參与寒冷信号传导的调控、抗寒基因表达的调控和抗寒蛋白活性的调节(Shinozaki andYamaguchi-Shinozaki 2007 ；Lata and Prasad, 2011 ;Qin 等，2011)。大多数冷和干旱响应的基因在它们的启动子里都有ー个或多个DRE/CRT顺式作用元件，它的核心序列是CCGAC。ー个被称之为CBF/DREBls的转录因子家族能够结合这个核心元件井能激活或诱导下游干旱或低温响应基因的表达，但是这类转类因子它们自身却是受低温的诱导然后才就进一步诱导含有DRE/CRT作用元件的下游基因的表达。因此，低温胁迫下的基因表达网络是ー个级联连锁反应过程。CBFs或DREBls基因的超表达，可在室温下启动下游基因的表达，并提高转化植物的耐寒能力。由于CBF/DREB1的转录是在将植物置于低温15Min后才开始的，Gilmour等(1998)提出了一种假说可能在常温的情况下那里已经有ー个转录因子，可能识别CBF的启动子并诱导其表达但在常温的情况下是以非活化的状态存在的，Gilmour将这个未知的转录因子称之为ICE1，并假设将植株置于低温的条件下，修饰ICEl或者与其互作的蛋白并允许ICEl结合到CBF的启动子并诱导CBF的表达。HOSl基因编码ー种环指泛素E3连接酶，它可以与ICEl蛋白结合并參与调控ICEl的泛素化降解，它是ICEl及其下游目标基因的负调控因子(Dong等，2006).在低温的过程中，SIZl蛋白起着SUMO E3连接酶的作用，在冷驯化的过程中，SIZl可以促进SUMO蛋白与ICEl蛋白的赖氨酸(K393)位点结合，从而阻止ICEl的泛素化降解，提高ICEl的稳定性并激活ICEl蛋白(Mi ura等，2007)。拟南芥的转录组分析结果表明，在ICEl功能缺失型突变体中，939个拟南芥冷响应基因中有369个(39. 3%)表达水平发生了变化。其中133个编码冷响应转录因子的基因中有52个(39. 1%)表达水平发生了变化。另外，ICEl基因是组成型表达，但它的超表达可在低温下增强CBF3的转录表达并提高转基因植株的耐寒能力。因此，ICEl基因在拟南芥的抗寒中起着关键性的调控作用。Lee等(2005)采用基因芯片的方法从整个转录组水平上研究了 ICEl在拟南芥耐寒及其在基因表达调控中的作用，icel突变体影响了ー些低温胁迫早期应答基因以及受ABA或生长素调控基因的表达，进ー步验证了 ICEl在植物低温胁迫应答中起着关键性的核心作用。迄今，ICEl基因已从拟南芥(Chinnusamy 等，2003)、芥菜(Wang 等，2005)、杨树(Lin 等，2007)、小麦(Badawi 等，2008)、茶(Wang等，2012)、苹果(Feng等，2012)中分离得到。枳是柑橘产业中应用较广泛的ー种砧木，极抗寒，是研究木本植物抗寒性及克隆有关抗寒基因克隆问题的通想材料。因此，克隆积抗寒有关基因是抗寒基因工程的关键和基础。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供了一种从积(Poncirus trifoliata)中分离克隆的抗寒 转录因子基因，此基因可编码MYC (myelocytomatosis oncogene)类型的bHLH (basichelix-loop-helix，碱性螺旋-环-螺旋)家族转录因子，申请人将此基因命名为PtrlCEl，其序列为SEQ ID NO. I所示。本专利技术另ー个目的是提供了一种从积(Poncirus trifoliata)中分离克隆的转录因子基因在植物抗寒改良中的应用，通过农杆菌介导遗传转化方法将该转录因子转化烟草和柠檬，获得的转基因植株经生物学功能验证，表明本专利技术克隆的PtrICEl基因具有调控抗寒功能。为了实现以上目的，本专利技术采用以下技术方案申请人:利用植物基因克隆技术从枳中克隆得到ー个新基因PtrICEl，一种分离的PtrICEl基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO :I所示，其中161_1840bp处为该基因的编码区，包含1680bp的开放阅读框；编码559个氨基酸，其编码的氨基酸序列为序列表SEQ ID NO:2所示，等电点为5. 27，分子量为61kD。申请人:设计了克隆上述基因PtrICEl的cDNA序列的引物对，其核苷酸序列如下所示正向引物5，-TTGTCGACCTCTCTGCATCTGCTGAGCTGCTG-3，，即SEQ ID NO. 3 ；反向引物5’ -ATGGTACCACAATGTTCGGCTCCTCGAAGGGC-3，，即 SEQ ID NO. 4。利用农杆菌介导的遗传转化方法转化烟草和柠檬，获得的转基因植株，经生物学功能验证，表明本专利技术克隆的PtrICEl基因具有调控抗寒功能。在本专利技术的实施例部分，我们阐述了枳PtrICEl转录因子的分离、功能验证和应用。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点和效果l、PtrICEl基因的发现，为植物抗非生物逆境分子设计育种提供新的基因资源，为实施绿色农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业生产成本和实现环境友好。2、通过农杆菌介导遗传转化方法将该转录因子转化烟草和柠檬，获得的转基因植株，经生物学功能验证，表明本专利技术克隆的PtrICEl基因具有调控抗寒功能。附图说明图I为一种本专利技术的技术流程示意图。图2为一种本专利技术的PtrICEl基因在脱水、低温和盐胁迫下的表达示意图。其中图2A是本专利技术的基因在枳田间苗(未转基因)室温下脱水不同时间点的表达模式；图2B是枳的田间苗(未转基因)在4°C处理下，相应时间点取样，采用实时定量PCR分析本专利技术的基因相对表达量；图2C是枳的田间苗(未转基因)在200mM氯化钠处理下，相应时间点取样，采用实时定量PCR分析本专利技术基因的相对表达量。 图3为一种本专利技术的PtrICEl基因亚细胞定位示意图。其中图本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离的基因，其特征在于：PtrICE1基因，其核苷酸序列为SEQ？ID？NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种分离的基因，其特征在干PtrICEl基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO. I所示。2.根据权利要求I所述的ー种分离的基因，其特征在于所述基因的正向引物为5’-ITGTCGACCT...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘继红，黄小三，付行政，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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