本发明专利技术公开一种微生物谷氨酰胺转胺酶的分离纯化方法，是在链霉菌发酵液中加入50-200mg/L的分散酶处理，经乙醇沉淀、阴离子交换层析、阳离子交换层析，再经脱盐、浓缩、过滤、冻干后得到所述微生物谷氨酰胺转胺酶；其中，所述微生物谷氨酰胺转胺酶的纯度大于95%，比活力为20000-50000U/g。本发明专利技术工艺简单，可从微生物发酵产物中获得高纯度的谷氨酰胺转胺酶，酶的得率在70%以上。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
的分离纯化方法，具体涉及一种微生物谷氨酰胺转胺酶的分离纯化方法。
技术介绍
谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase,简称TG, EC2. 3. 2. 13 ;又称蛋白质-谷氨酸-Y-谷氨酰胺转胺酶)是一种催化酰基转移反应的酶。TG可作为酰基受体与蛋白质中赖氨酸残基的ε-氨基作用，形成ε_( Y-谷氨酰)Lys键，从而催化蛋白质分子内、分子间发生交联，蛋白质和氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酰胺基的水解，进而改变蛋白质功能性质，提高蛋白质的营养价值，在食品、生物制药、纺织等领域有广泛的应用。谷氨酰胺转胺酶广泛存在于动物、植物和微生物中，包括源自动物的谷氨酰胺转胺酶(Guinea-pig Transglutaminase, GTG)和源自微生物的谷氨酸胺转胺酶(Microbial Transglutaminase,MTG)。GTG主要从动物组织中提取，但是由于其分离纯化过程复杂、来源较少、价格昂贵，极大地限制其在工业生产上的应用。与GTG相比，MTG在应用上具有对Ca2+的非依赖性，对热、pH的稳定性以及易储藏性等优点。研究表明MTG具有与GTG类似的作用和功能，比如MTG可以催化I型胶原蛋白发生交联，形成耐高温的胶(Nomura Y, et. al; Biosci Biotechnol Biochem.2001 Apr; 65 (4) :982-5);可以交联明胶，形成良好的多孔网状物用于止血和伤口粘合(Liu Y, et. al, J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2009 Oct; 91 (I) : 5-16 ;中国专利:200780051215. 4,200980131973. 6 ;美国专利8133484 ;欧洲专利W02012017415、EP2303344) ； MTG与明胶作用形成的交联物不易受热溶解，具有较好的热稳定性(Chen T,Embree HD, et. al ; Biomaterials. 2003 Aug; 24 (17) : 2831-41，美国专利5，834，232)等，因此微生物谷氨酰胺转胺酶可作为潜在医用止血材料的交联剂用于止血、伤口粘合等外科手术中。但是，目前市场上的MTG主要用于食品加工领域，且采用传统分离纯化工艺制备，制备过程中酶的得率、纯度以及比活力都不高，仍含有多种杂蛋白，难以满足作为医用材料的要求。
技术实现思路
本专利技术克服现有技术的上述缺陷，创新提出了一种微生物谷氨酰胺转胺酶的分离纯化方法，即利用分散酶在室温条件下对链霉菌发酵液中的pro-MTG (MTG的前体形式)进行水解处理后得到具有活性的MTG，然后，经乙醇沉淀，结合阴、阳离子交换层析对MTG进行纯化，在提高的同时，得到了高纯度(>95%)和酶比活力(>20000U/g)的MTG，且提高了活性MTG得率。本专利技术方法分离纯化得到的微生物谷胺酰胺转胺酶符合医用材料的要求，能够用于医用止血材料和粘合剂。本专利技术旨在提供一种微生物谷氨酰胺转胺酶的分离纯化方法，从茂源链霉菌突变菌株发酵液中获取高纯度的MTG，用作医用止血材料和粘合剂原料。本专利技术中，源自微生物的谷氨酰胺转胺酶(即MTG)属胞外酶，主要来源于微生物中的链霉菌，如吸水链霉菌、茂源链霉菌等，其分子量大小在38KD左右，酶的活性中心包含有一个游离的Cys巯基。本专利技术提出的一种微生物谷氨酰胺转胺酶的分离纯化方法，包括，在链霉菌发酵液中加入50-200mg/L的分散酶处理；然后，经乙醇沉淀、阴离子交换层析、阳离子交换层析，再经脱盐、浓缩、过滤、冻干后得到所述微生物谷氨酰胺转胺酶；其中，所述微生物谷氨酰胺转胺酶的纯度大于95%，比活力为20000-50000U/g。其中，所述链霉菌发酵液为茂源链霉菌STK4突变菌株发酵液；所述微生物谷胺酰胺转胺酶的第10位氨基酸为丝氨酸或苏氨酸；第241位氨基酸为丙氨酸或甘氨酸；第284位氨基酸为缬氨酸或者酪氨酸。本专利技术中，“链霉菌发酵液”是指茂源链霉菌STK4菌株在发酵培养基中培养48-72小时后的发酵液。 本专利技术中，“茂源链霉菌STK4突变菌株”是指茂源链霉菌STK4野生菌株经紫外辐照诱变后产生的MTG突变菌株。本专利技术中，所述阴离子交换层析步骤中，上样缓冲液为PH7. O- 7. 5的TriS-HCl缓冲液；洗脱液为0-2mol/L的NaCl溶液。本专利技术中，所述阳离子交换层析步骤中，上样缓冲液为pH 5. 5-6. 5的磷酸氢钠缓冲液；洗脱液为pH 7. 0,0-lmol/L的NaCl溶液。本专利技术中，在所述样品上离子交换层析柱前用O. 45μπι - 0.22μπι的纤维过滤膜进行过滤。本专利技术中，所述样品冻干前用纳米滤膜过滤。本专利技术中，所述微生物谷氨酰胺转胺酶的得率大于70%. 本专利技术中，所述微生物谷氨酰胺转胺酶的内毒素水平<4EU/g。本专利技术中，所述微生物谷氨酰胺转胺酶可用做伤口止血和医用粘合材料。利用本专利技术微生物谷胺酰转氨酶(MTG)的分离纯化方法，可从微生物发酵产物中获得高纯度的谷氨酰胺转胺酶，纯化后获得的微生物谷氨酰胺转胺酶蛋白的纯度大于95%，比活力达到20000-50000U/g，酶的得率在70%以上，既能够满足医用止血材料和粘合剂的要求，又实现高效生产。附图说明图I、本专利技术分离纯化方法中的阳离子交换层析色谱图。其中，峰I表示pH7. O的磷酸二氢钠缓冲液洗脱的杂蛋白峰；峰2表示pH7. O含200mM NaCl的磷酸二氢钠缓冲液洗脱的谷氨酰胺转胺酶目的蛋白峰。图2、本专利技术分离纯化过程中的谷氨酰胺转胺酶的电泳图。其中，Marker :蛋白质分子 marker ； 条带I :发酵液电泳图；条带2 :乙醇沉淀产物电泳图；条带3 :阴离子交换层析后的穿透液电泳图；条带4;阳离子交换层析后的MTG电泳图。图3、不同温度下本专利技术分离纯化得到的突变MTG和野生MTG的酶活比较。具体实施方式结合以下具体实施例和附图，对本专利技术作进一步的详细说明，本专利技术的保护内容不局限于以下实施例。在不背离专利技术构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本技术中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本专利技术的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本专利技术没有特别限制内容。如按照SambiOOk等人，分子克隆，实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)所记载内容,或按照厂商的建议条件。本专利技术分离纯化方法通过分散酶处理一乙醇沉淀一阴离子交换层析一阳离子交换层析这样的特别设定的过程对发酵液中的MTG进行处理并进行分离纯化，得到本专利技术目的产物微生物谷氨酰胺转胺酶，即MTG。本专利技术中，首先加入适量分散酶对发酵液进行处理，分散酶在特定条件下催化pro-MTG水解形成具有活性的MTG。通过分散酶处理使发酵液中的pro-MTG转化为MTG，从 而最大程度地保证得到的都是具有活性的MTG (表I所示)，增加了活性MTG的得率。然后，用乙醇沉淀对发酵液中的MTG进行初步纯化。通过调节发酵液中的乙醇浓度以及pH，使其达本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种微生物谷氨酰胺转胺酶的分离纯化方法，其特征在于，在链霉菌发酵液中加入50？200mg/L的分散酶处理，经乙醇沉淀、阴离子交换层析、阳离子交换层析，再经脱盐、浓缩、过滤、冻干后得到所述微生物谷氨酰胺转胺酶；其中，所述微生物谷氨酰胺转胺酶的纯度大于95%，比活力为20000？50000U/g。
【技术特征摘要】
1.ー种微生物谷氨酰胺转胺酶的分离纯化方法，其特征在干，在链霉菌发酵液中加入50-200mg/L的分散酶处理，经こ醇沉淀、阴离子交换层析、阳离子交换层析，再经脱盐、浓缩、过滤、冻干后得到所述微生物谷氨酰胺转胺酶；其中，所述微生物谷氨酰胺转胺酶的纯度大于95%，比活力为20000-50000U/g。2.如权利要求I所述的微生物谷氨酰胺转胺酶的分离纯化方法，其特征在于，所述链霉菌发酵液为茂源链霉菌STK4突变菌株发酵液；所述微生物谷胺酰胺转胺酶的第10位氨基酸为丝氨酸或苏氨酸；第241位氨基酸为丙氨酸或甘氨酸；第284位氨基酸为缬氨酸或者酪氨酸。3.如权利要求I所述的微生物谷氨酰胺转胺酶的分离纯化方法，其特征在于，所述阴离子交换层析步骤中，上样缓冲液为PH 7. 0-7. 5的Tris-HCl缓冲液；洗脱液为0-2mol/L的NaCl溶液。4.如权利要求I所述的微生物谷氨酰胺转胺...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩红辉，刘明耀，陈益华，易正芳，金明飞，常忠义，
申请(专利权)人：华东师范大学，
类型：发明
国别省市：
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