监测肾损伤的新型试剂和试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及监测肾损伤的新型试剂和试剂盒。本发明专利技术人从全长的NGAL鉴定出关键的抗原决定簇，以含有这些关键抗原决定簇的短肽混合物作为免疫原，获得了特异性抗NGAL的多克隆抗体。本发明专利技术提供的抗原片段及其多克隆抗体，制备方法简单，效价高，特异性强，灵敏度高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物技术和免疫性领域；更具体地，本专利技术涉及监测肾损伤的新型试剂和试剂盒。
技术介绍
嗜中性粒细胞明胶酶相关性脂运蛋白(NGAL)以往作为一种中性粒细胞激活标志为人们所知，当入侵微生物引起中性粒细胞脱颗粒和颗粒蛋白胞吐时，NGAL被释放到血液中。后来，NGAL被报导可作为尿生物标记，用来检测肾小管细胞损伤的早期发作。美国专利申请2005/0272101公开了血清中NGAL用于同样的目的。PCT申请W02006/066587公开了怎样利用尿或血浆或血清中的NGAL进行检测。因此，NGAL已经作为一种疾病发作的标 记物被人们研究和应用。人NGAL共包括198个氨基酸。尽管NGAL作为疾病诊断的标志物已经为人们所了解，然而由于它的全长蛋白本身免疫原性并不理想，免疫获得抗体的过程中还存在抗体效价差，不稳定的缺陷。因此，本领域还有必要进一步优化针对以上检测NGAL的抗体，以期提高肾损伤诊断的准确率。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种监测肾损伤的新型试剂和试剂盒。在本专利技术的第一方面，提供一种分离的多肽，它是如SEQ ID NO :1或SEQID NO 2所示氨基酸序列的多肽，所述的多肽来源于嗜中性粒细胞明胶酶相关性脂运蛋白(NGAL)。在本专利技术的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，它编码所述的多肽。在本专利技术的另一方面，提供一种多肽混合物，其由SEQ ID NO :I和SEQ IDNO 2所示氨基酸序列的多肽混合而成。在一个优选例中，SEQ ID NO :I和SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的多肽混合的比例按照重量比为I : 5 5 I。较佳地，SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的多肽混合的比例按照重量比为I : 3 3 : I。在本专利技术的另一方面，提供所述的多肽混合物的用途，用于制备特异性抗嗜中性粒细胞明胶酶相关性脂运蛋白的抗体。在本专利技术的另一方面，提供一种用于检测肾损伤的抗体，其是由所述的多肽混合物免疫动物而获得。在一个优选例中，所述的抗体是多克隆抗体。在本专利技术的另一方面，提供一种制备抗体的方法，所述方法包括以所述的多肽混合物免疫动物，从免疫后的动物体内分离出特异性抗嗜中性粒细胞明胶酶相关性脂运蛋白的抗体。在本专利技术的另一方面，提供一种用于检测肾损伤的试剂盒，包括固相载体，以及位于固相载体上的多克隆抗体,该多克隆抗体由所述的多肽混合物免疫动物而获得。在一个优选例中，所述的固相载体是包被板、试纸和/或微球。在另一优选例中，所述的检测试剂盒还包括标记的检测抗体，显色剂，洗涤液，终止液和/或使用说明书。本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图I、ELISA反应后，在A405nm测酶标板上各孔的吸光度，所获得的读数。其中A、B行微孔中包被SEQ ID NO: I多肽；在C、D行微孔中包被SEQID NO :2多肽。1、2列为 #YZ2391号兔子I : 1000稀释度的血清(多抗)；3、4列为#YZ2391号兔子I : 10，000稀释度的血清；5、6列为#YZ2391号兔子I : 100，000梯度稀释血清；7、8列为#YZ2392号兔子I : 1000稀释度的血清；3、4列为#YZ2392号兔子I : 10，000稀释度的血清；5、6列为#YZ2392号兔子I : 100，000梯度稀释血清。A、C孔加入预免疫血清；B、D孔加入最终获得的血清。图2、SEQ ID NO :1(上图)、SEQ ID NO :2(下图)分别免疫#YZ2392兔子后不同稀释度的抗体的滴度(效价)测定结果。具体实施例方式在本领域人员的实践中经常发现，由于蛋白的抗原决定簇易于被包埋在蛋白空间结构的内部，因此难以找到一种特异性高的抗体。针对上述技术难题，为了高效获得检测NGAL肾损伤标志物的特异性抗体，本专利技术人经过深入的研究，从全长的NGAL上分别鉴定出关键的抗原决定簇，以含有这些关键抗原决定簇的短肽混合物作为免疫原，分别获得了特异性抗NGAL的多克隆抗体。本专利技术提供的抗原片段及其多克隆抗体，制备方法简单，效价高，特异性强，灵敏度高。本专利技术中，“分离的多肽”是指多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质，本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化该多肽，基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上产生单一的主带。本专利技术的SEQ ID NO :1-2任一所述的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选合成多肽。本专利技术所述的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。编码所述的多肽的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。编码本专利技术的多肽的多核苷酸通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本专利技术所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本专利技术的多肽的DNA序列。本专利技术还提供了一种多肽混合物，其由SEQ ID NO : I和SEQ ID NO : 2所示氨基酸序列的多肽混合而成。多肽制备成混合物联合用于作为免疫原进行动物免疫，可获得高效价的抗体，免疫的效果显著优于单条多肽的免疫。本专利技术还提供了可特异性识别NGAL的抗体。这里，“特异性”是指抗体能识别和结合于NGAL蛋白，但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本专利技术的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。本专利技术更优选多克隆抗体，本专利技术中，所用的术语“多克隆抗体”(多抗)指一组与抗原有特异性结合能力的球蛋白，其是由抗原刺激机体，产生免疫学反应后，由机体的浆细胞合成并分泌的。抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体。由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体。多克 隆抗体的好处在于它们的效价高，特异性高，亲和力强，灵敏度好，便于人为处理和质量控制，此外，多克隆抗体制备相对容易，更为经济。多克隆抗体可用本领域技术人员熟知的各种方法来制得。本专利技术的多肽混合物，可被施用于动物(如兔，小鼠，大鼠等；较佳地是兔)以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达本专利技术的多肽的细胞也可用来免疫动物来生产抗体。多克隆抗体可以用淋巴结注射法，皮下多点注射法，多途径联合注射法等免疫方法制得。实施例中采用多肽混合物与弗氏佐剂混合后，背部皮下多点注射，免疫新西兰兔；并进行加强免疫；最终获得高效价的多克隆抗体。利用本专利技术的多肽混合物，也可以生产单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见 Kohler 等人,Nature 256 ；495,1975 ；Kohler 等人,Eur. J. Immunol. 6 511,1976 ；Kohler 等人，Eur. J.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的多肽，其特征在于，它是如SEQ？ID？NO：1或SEQ？ID？NO：2所示氨基酸序列的多肽，所述的多肽来源于嗜中性粒细胞明胶酶相关性脂运蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种分离的多肽，其特征在于，它是如SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽，所述的多肽来源于嗜中性粒细胞明胶酶相关性脂运蛋白。2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它编码权利要求I所述的多肽。3.一种多肽混合物，其特征在于，其由SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽混合而成。4.如权利要求3所述的多肽混合物，其特征在于，SEQID NO : I和SEQ IDNO 2所示氨基酸序列的多肽混合的比例按照重量比为I : 5 5 : I。5.权利要求3或4所述的多肽混合物的用途，用于制备特异性抗嗜中性粒细胞明胶...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡逸强，闵洪中，李锐，
申请(专利权)人：李锐，
类型：发明
国别省市：