O型口蹄疫病毒4个亚型的基因工程多肽疫苗及其用途，选择O型口蹄疫病毒常见的4个亚型(Wuhan?2006，GenBank：DQ478936.1；India?2004，GenBank：AY593828.1；China/1/99?Tibet，GenBank：AF506822.2；Akesu?2007，GenBank：AF511039.1)，取VP4的T-细胞helper15个氨基酸的片段的DNA序列及4种亚型VP1?B细胞决定簇的DNA序列串联【VP4T?helper-VPI(Wuhan2006)-VP1(India?2004)-VP1(China/1/99Tibet)-VP1(Akesu?2007)】，克隆，不含有载体蛋白，构建1个基因工程菌。经过高密度发酵，细胞破碎、包涵体复性，融合蛋白的分离纯化，冻干后即可获得抗原蛋白产品，与佐剂匀浆形成多肽疫苗。该疫苗含有SEQ?ID所示的核酸序列所编码的多肽，安全性好，免疫效价高，一次免疫可涵盖O型口蹄疫病毒常见的4个亚型，适于大规模生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种新型的口蹄疫疫苗，特别是一种由基因工程方法生产的O型口蹄疫病毒中 4 个亚型(Wuhan 2006，GenBank DQ478936. I ; India 2004，GenBank AY593828. I ；China/l/99Tibet, GenBank AF506822. 2 ；Akesu 2007，GenBank AF511039. I)的基因工程多肽疫苗及其制备方法和用途。
技术介绍
口蹄疫(Foot and mouth disease, FMD)是畜牧业中偶蹄类动物(猪、牛、羊及骆驼)的一种急性、热性、高度接触性传染病，造成疫情发生的国家和地区的巨大的经济损失。口蹄疫是一个全球性的问题，这种疾病的流行曾对德国(1937-1938)、土耳其(1964-1965)、英国(1967_1968、2007、2009)、奥地利(1973)、法国(1974)、韩国(2000、2002、2010、2011)、日本(2000、2010)、朝鲜(2011)等国家造成巨大的经济损失。目前，世界上大多数的国家属于“口蹄疫疫区”，非口蹄疫的国家或地区仅占少数。我国是口蹄疫疫区，每年都有数次至十数次疫情报道至世界动物卫生组织(Office international desepizooties, 0IE)。口蹄疫的临床诊断特点为口腔粘膜、蹄部和乳房的皮肤发生水疱和溃烂，由口蹄疫病毒引起，对于畜牧业，猪、牛及羊的饲养及畜产品的贸易危害极大。口蹄疫病毒(Footand mouth disease virus, FMDV)属于细小RNA病毒,对猪、牛及羊传染途径多,毒力强，一头病牛的排毒量可感染100万头牛，I克病猪蹄部水疱皮可使10万头猪感染发病。易于传播，传播迅速，流行面广，生产性能下降，防治费用高，发病率100 %，成年畜死亡率一般1-2 %，但幼畜高达50 %，甚至100 %。口蹄疫病毒颗粒中含有一条正链极性的、由8500个核苷酸组成的单链RNA。病毒颗粒的囊膜包括包绕单链RNA的四种结构蛋白VPl (分子量34000)、VP2 (分子量30000)、VP3(分子量26000)、VP4(分子量13500)。四种结构蛋白每种60个分子构成一个二十面体病毒粒子。二十面体的顶点由结构蛋白VPl的免疫决定簇区域为141-160区域和200-213区域。口蹄疫病毒具有显著的抗原多样性，目前发现的FMDV有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3(即南非1、2、3型)和Asial (亚洲I型)7个血清型。每种血清型还可以继续分成多种亚型。中国原为O型FMD流行区，从2009年7月份开始至2010年6月，我国总共向世界动物卫生组织报告了 36起口蹄疫疫情，其中2010年1-6月份，向世界卫生组织上报猪口蹄疫疫情12次，均为涉及不同亚型的O型口蹄疫。对于口蹄疫FMD，注射疫苗是目前预防口蹄疫的最有效手段。但是，中国存在多个O型口蹄疫的亚型，主要的就有8种，为免疫工作带来难题。免疫疫苗有免疫疫苗有I、减毒疫苗及灭活疫苗传统的减毒疫苗及灭活疫苗是利用大量培养动物细胞，然后感染口蹄疫病毒，经过培养、分离病毒，再用化学试剂使病毒灭活或减毒后制备而成。减毒疫苗及灭活疫苗只能针对O型口蹄疫的某一个亚型，不能覆盖多种亚型。由于病毒不断发生变异，目前我国O型口蹄疫各种亚型均有发生。减毒疫苗及灭活疫苗是我国目前主要使用的口蹄疫疫苗，但是，未能满意控制O型口蹄疫疫情，已不能满足畜牧业生产的需要。2、核酸疫苗核酸疫苗，又称DNA疫苗。其机理是动物细胞摄取质粒DNA后，动物细胞可以使质粒DNA表达形成多肽抗原，引起动物的特异性免疫应答。口蹄疫核酸疫苗在国内外的研究中均显示其对口蹄疫具有一定的免疫保护效果，但是目前为止，其免疫保护效果与灭活疫苗相比未显示其理论上的优势。就目前的技术而言，核酸疫苗的生产周期长，其技术大规模生产困难。其次，最为重要的是安全性问题，主要有以下几个方面质粒DNA可能诱导自身免疫反应；肌肉注射质 粒后，仅有很少部分被肌细胞摄取，质粒去向如何尚待进一步查明；影响核酸疫苗诱发机体免疫应答的因素很多，效果不太确定；外源DNA注入体内后，可能整合到宿主基因组上，使宿主细胞抑癌基因失活或癌基因活化，使宿主细胞转化成癌细胞。3、多肽疫苗多肽疫苗能克服常规疫苗的缺点，很早就被认为是动物传染病预防用的终极疫苗。1982年研发出人工合成的多肽苗。使用大肠杆菌作为寄主细胞发酵培养时间只需20个小时，周期比用动物细胞生产灭活疫苗短得多，基因工程疫苗对环境没有污染，没有泄露的危险，非常安全，且生产出的疫苗在贮藏、运输和使用过程中不需要冷藏，效价稳定。因此，制备出免疫效价增高而且可用于多个亚型及多价基因工程口蹄疫疫苗是我们不断追求的目标。20多年来多肽疫苗的研究多集中在VPl外壳蛋白的B细胞单一免疫决定簇，进一步研究表明结构蛋白VPl的免疫决定簇为141-160区域和200-213区域，这两个区域的多肽片段与载体蛋白经化学联接后产生的抗体能中和病毒粒子(Nature，1982，298 :30-33 ；J.Virology,2000, 74 :4902-4907 ；J.Virology,2001,75 :3164-3174 ；J. Virology,2003,77 :8633-8640 ；Vaccine, 2002, 20 :2603-2610)。然而因机体中和抗体产生较少，合成多肽疫苗免疫动物后所起的免疫保护作用并没有人们当初设想的那么理想，利用价值甚至一度被否认。在诱导机体产生免疫的过程中，单一的中和抗原表位是远远不够的。近年来的研究证明除了 VPl的B细胞免疫决定簇之外，需要VP4的T细胞免疫簇协同作用，可获得很好的免疫中和抗体保护效果。如复旦大学等单位研制的Asial基因工程疫苗含T-helper和VPl免疫决定簇疫苗具有保护效果，能够产生中和抗体。再如美国UBI公司合成的多肽疫苗具有T-细胞Helper多肽与VPl的B细胞免疫决定簇多肽，大大增强了中和抗体的作用(10倍左右)，具有明确的免疫保护效果。具有良好的安全性无发热症状、无过敏反应发生、注射部位无吸收不良现象、对妊娠母猪的健康状况和妊娠没有影响，对产仔成绩也没有影响。但是，其缺点是只能针对O型口蹄疫的某一个亚型，在口蹄疫病毒迅速变异的今天，已不能满足需要。目前需要大量、廉价生产能覆盖多个O型口蹄疫亚型多肽类疫苗。但是，化学合成超过20个氨基酸的肽链非常昂贵。因此，需要发展生物技术通过基因工程大量生产多肽。然而，实际应用还距离很远。根据近20年对多肽的研究报告，除胰岛素外，基因工程并不比化学合成具有优势。根本原因是基因工程的理论发展与实际应用尚有待发展，况且，多肽在体内迅速降解不利于相应抗体的诱导产生。应利用基因工程技术制备FMDV多肽疫苗。与其他基因工程多肽产品一样，生产需解决一系列的上游设计与下游工艺问题。尽管有很多报道，离应用尚远。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服已有技术的缺陷，提供一种新型的O型口蹄疫病毒中4个亚型的基因工程多肽疫苗及其制备方法和用途。本专利技术的O型口蹄疫病毒中4个亚型的基因工程多肽疫苗，由I个基因工程菌生产制备，口蹄疫病毒外壳蛋白有四种，即VP本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种O型口蹄疫病毒中4个亚型的基因工程多肽疫苗，由1个基因工程菌生产制备，口蹄疫病毒外壳蛋白有四种，即VP1、VP2、VP3、VP4，该基因工程菌选择O型口蹄疫病毒常见的4个亚型，分别是：Wuhan？2006，GenBank：DQ478936.1；India？2004，GenBank：AY593828.1；China/1/99Tibet，GenBank：AF506822.2；Akesu？2007，GenBank：AF511039.1，取又VP4的T？细胞helper15个氨基酸的片段的DNA序列及4种亚型VP1？B细胞决定簇的DNA序列串联，克隆，多肽疫苗的核苷酸排列序列SEQ？ID为：GAATTCAGCATCATCAACAACTACTACATGCAGCAGTACCAGAACAGCATGAACGGTAGCTGCCGTTACAGCGATAGCAACGTTAGCAAACTGCGTGGTGATCTGCAGGTTCTGGATCAGAAAGCGGCGCGTCCGCTGCCGCGTTACAAACAGAAAATCGTTGCGCCGGCGAAACAGCTGCTGgGATCTAACGGTAACTGCAAATACGCGGATGGTCCGGTTGCGAACGTTCGTGGTGATCTGCAGGTTCTGGCGCAGAAAGCGGCGCGTGCGCTGCCGCGTCACAAACAGAAAATCGTTGCGCCGGTTAAACAGCTGCTGgGATCTAACGGTAACTGCAAATACGATGAAAGCCCGGTTACCAACGTTCGTGGTGATCTGCAGGTTCTGGCGCAGAAAGCGGCGCGTACCCTGCCGCGTCACAAACAGAAAATCGTTGCGCCGGTTAAACAGCTGCTGgGATCTAACGGTAGCTGCCGTTACAGCAACAGCAACGTTAGCAACGTTAGCGGTGATCTGCAGGTTCTGGCGCAGAAAGCGGCGCGTGCGCTGCCGCGTCACAAACAGAAAATCGTTGCGCCGGCGAAACAGCTGCTGTAGGTCGAC。...
【技术特征摘要】
1.一种O型口蹄疫病毒中4个亚型的基因工程多肽疫苗，由I个基因工程菌生产制备，口蹄疫病毒外壳蛋白有四种，即VP1、VP2、VP3、VP4，该基因工程菌选择O型口蹄疫病毒常见的 4 个亚型，分别是=Wuhan 2006，GenBank DQ478936. I ;India 2004，GenBank AY593828. I ；China/l/99Tibet, GenBank AF506822. 2 ；Akesu 2007，GenBank AF511039. 1，取又VP4的T-细胞helperl5个氨基酸的片段的DNA序列及4种亚型VPl B细胞决定簇的DNA序列串联，克隆，多肽疫苗的核苷酸排列序列SEQ ID为GAATTCAGCATCATCAACAACTACTACATGCAGCAGTACCAGAACAGCATGAACGGTAGCTGCCGTTACAGCGATAGCAACGTTAGCAAACTGCGTGGTGATCTGCAGGTTCTGGATCAGAAAGCGGCGCGTCCGCTGCCGCGTTACAAACAGAAAATCGTTGCGCCGGCGAAACAGCTGCTGgGATCTAACGGTAACTGCAAATACGCGGATGGTCCGGTTGCGAACGTTCGTGGTGATCTGCAGGTTCTGGCGCAGAAAGCGGCGCGTGCGCTGCCGCGTCACAAACAGAAAATCGTTGCGCCGGTTAAACAGCTGCTGgGATCTAACGGTAACTGCAAATACGA...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴晓琰，赵泓，龚铁军，
申请(专利权)人：吴晓琰，赵泓，龚铁军，
类型：发明
国别省市：
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